基于自然杀伤细胞与肝星状细胞的关系探讨虫草菌丝抗肝纤维化的免疫调控机制与效应物质

研究证实自然杀伤细胞（NK）功能降低是慢性肝损伤向肝纤维化发展的重要病理机制，虫草菌丝(虫草)有良好的免疫调节作用。基于前期虫草促进肝星状细胞(HSC)凋亡、抗肝纤维化及增加急性损伤肝脏NK数量的工作基础，围绕"NK活化-HSC凋亡"之关系，开展：①体内实验虫草预防与治疗给药，以NK激活剂与抑制剂对照，观察虫草影响NK活性、HSC凋亡以预防或逆转肝纤维化作用；②体外分离NK/HSC，与药物血清共孵育，阐明虫草影响NK活性及其促进活化HSC凋亡的主要作用机制；体外分离NK/HSC，与虫草组分或成分共孵育，发现虫草影响NK活性以促进活化HSC凋亡的活性物质。该研究将证实"虫草抗肝纤维化作用机制主要不在于直接影响HSC而是调节NK活性而间接促进活化HSC凋亡，且该作用具有内在效应物质"之科学假说。本研究不仅进一步揭示虫草防治肝纤维化的作用机制，并为其基于免疫调控防治慢性肝病肝纤维化提供理论依据。

本课题基于NK细胞与肝星状细胞病理联系，及虫草菌丝抗肝损伤与增加肝脏NK细胞数量的工作基础，探讨虫草菌丝调节NK细胞而杀伤活化肝星状细胞的作用机制及其效应物质。通过复制CCl4小鼠肝纤维化模型，并设NK细胞激活剂polyI:C与抑制剂ASGM-1对照，动态观察NK细胞变化，虫草菌丝干预治疗，发现：（1）与正常组相比，模型组小鼠的肝功能水平随造模时间的增加而表现为逐渐加重；模型小鼠在造模1周后，肝内NK细胞占肝内淋巴细胞比例上升，数量增多；在造模2周和造模4周后，NK细胞占肝内淋巴细胞比例逐渐下降；（2）连续灌胃4周虫草菌丝，肝脏淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞比例不同程度下降，B细胞和NKT细胞比例均增多；肝脏NK细胞表面激活性受体NKG2D表达增加；血清肝功能改善、肝组织的炎症减轻；活化肝星状细胞减少，肝组织羟脯氨酸含量减低、肝纤维化减轻。. 体外筛选虫草菌丝抗肝纤维化的活性物质。HPLC检测发现，虫草菌丝中主要含鸟苷、尿苷、腺苷、麦角甾醇4种物质。采用肝细胞损伤模型与LX-2肝星状细胞活化模型，腺苷、鸟苷、尿苷、麦角甾醇共孵育，发现鸟苷对肝细胞损伤模型有保护作用；麦角甾醇对LX-2肝星状有明显抑制作用，随着浓度的升高，麦角甾醇对活化的LX-2肝星状细胞α-SMA表达呈明显下调作用。磁珠分离原代肝脏NK细胞，观察麦角甾醇对肝脏NK细胞活力的影响。结果发现LX-2肝星状细胞与麦角甾醇共孵育后，麦角甾醇明显抑制肝星状细胞增殖与肝星状细胞骨架蛋白表达；与不同浓度麦角甾醇孵育后，NK细胞存活率降低，但随麦角甾醇作用浓度增大，NK细胞存活率有上升趋势。本项目阐明了虫草菌丝调节NK细胞功能的抗肝纤维化作用机制及效应物质基础，不仅揭示了虫草菌丝防治肝纤维化的作用机制，并为基于免疫调控防治慢性肝病肝纤维化提供理论依据。本项目发表SCI论文5篇，已投稿论文2篇，参加国内外学术会议2次，获上海中医药科技奖一等奖1项目。