内源性配体对肝星状细胞及库普否细胞Toll样受体4信号途径的激活与肝纤维化发生

活化肝星状细胞（HSC)和库普否细胞（KC）均有完整的Toll样受体4（TLR4）信号途径并受其外源性配体细菌脂多糖（LPS）激活。已发现一些损伤相关物质是TLR4的内源性配体，可能影响HSC及KC的生物学特性并促进肝纤维化发生。本研究将建立TLR4基因敲除HSC及KC株，以及重建外源性人TLR4的主要等位基因和二个影响TLR4功能的T399I、D299A单核苷酸多态性（SNP)基因表达的HSC和KC细胞株，以此为有利工具探讨TLR4内源性配体及TLR4 基因多态性对这两种细胞的炎症表型、促纤维化发生、凋亡特性以及细胞相互作用等生物学特性的影响和信号传导途径，并在体内肝纤维化动物模型研究TLR4内源性配体。研究结果将验证"损伤相关内源性配体激活HSC及KC的TLR4信号而激发和扩大炎症反应并促进肝纤维化发生"的设想，是对肝纤维化发生机制的重要补充，并有助于新的抗肝纤维化治疗策略的产生。

活化肝星状细胞（HSC）具有完整的Toll 样受体4（TLR4）信号途径并受TLR4外源性配体细菌脂多糖（LPS）激活。本研究通过建立永生化野生型（JS1）和TLR4基因敲除型（JS2）HSC细胞株，体外转染转录因子NF-κB或AP-1反应性报告质粒，从几种候选物质中筛选出高迁移率族蛋白B1（HMGB1），能以TLR4依赖的方式激活下游转录因子活性，促进HSC的炎症表型和在TGF-β1刺激下的纤维化相关蛋白的表达。通过转录组水平的研究发现，TLR4信号对HSC的基因表达谱、细胞信号途径和基因相互作用关系网络具有重要调节作用，可影响HSC的数千种基因的差异表达，其中上调基因归属于17条信号途径，包括p53、mTOR、NOD样受体、Jak-STAT、趋化因子、粘着斑（Focal adhesion）、肿瘤路径（pathway in cancer）的信号通路；下调基因归属于10条信号途径，其中包括细胞粘附分子、吞噬体、轴突导向及抗原呈递等信号通路；经逆转录实时定量PCR、蛋白印迹、ELISA方法验证了其中一些纤维化发生、基质重建、转录因子、分泌型生长和趋化因子基因的差异表达。通过基因相互作用网络和共表达关系网络分析筛选出了其中起核心调控作用的基因群体。研究还发现LPS或HMGB1刺激下JS1、JS2两种细胞的转录谱改变也有显著差别。在JS1中LPS可上调参与Toll样受体、神经营养因子、免疫、剪接体和核苷酸切除修复、糖原溶解及糖异生等信号通路的基因，下调PPAR信号通路； HMGB1刺激JS1细胞主要上调谷胱甘肽及细胞色素p450药物代谢通路基因，下调泛素介导的蛋白溶解、肿瘤路径信号通路基因，其核心作用分子和调控基因存在差别。在JS2细胞中LPS及HMGB1刺激下差异表达基因相互作用网络简单并缺少显著核心调控因子。共表达网络群体与JS1细胞相比缺少相似性。拓扑分析两种细胞TLR4依赖的、LPS及HMGB1诱导的共同差异表达基因，获得29个主要的功能模块，影响细胞骨架和细胞外基质形成、物质代谢、整合素信号传导通路、氧化应激、趋化因子及受体、跨膜受体信号传导、免疫等方面的功能。研究结果提示TLR4信号途径及其在内、外源性配体刺激下的激活对HSC的功能具有重要影响，验证和丰富了"损伤相关内源性配体激活HSC的TLR4信号而激发和扩大炎症反应并促进肝纤维化发生"的设想。