IbSLF基因在甘薯种内杂交不亲和反应中的功能解析

Intraspecific cross-incompatibility is the characteristic of sweetpotato. It has been the serious obstacle for sweetpotato crossbreeding and germplasm resources utilization. At present, the related researches mainly focus on the selection of overcoming reagent and physiological mechanism, but few for molecular mechanism, especially for gene function research. Our previous study by transcriptomics comparison revealed that IbSLF gene might play an important role in sweetpotato intraspecific cross-incompatibility. The expression of IbSLF gene is positively correlated with intraspecific cross-compatibility. According to these, we will clone the IbSLF gene in this study, and transform its over-expression and RNA interference vectors into sweetpotato by genetic transformation system to research the gene function in sweetpotato intraspecific cross-incompatibility. Moreover, in order to understand the molecular mechanism regulated by IbSLF gene in sweetpotato intraspecific cross-incompatibility, we will carry out transcriptome sequencing for transgenic plants to analyze downstream genes and signal pathway that maybe regulated by the IbSLF, and isolate its interacting protein by cross-linking mass spectrometry. The results of this study will provide a basis for sweetpotato intraspecific cross-incompatibility overcoming and further research in molecular mechanism.

种内杂交不亲和性严重限制了甘薯育种及种质资源的利用，目前相关研究主要集中在克服试剂的筛选及生理机制方面，有关分子机制尤其是基因功能研究还鲜见报道。本项目前期通过转录组学比较分析发现IbSLF基因对甘薯种内杂交不亲和性的调控可能具有重要作用，其基因表达与种内杂交亲和性呈高度正相关。本研究将对IbSLF基因进行分离克隆，通过甘薯遗传转化体系将IbSLF基因过表达及沉默载体转入甘薯，对IbSLF基因在甘薯种内杂交不亲和反应的功能作用进行研究，并通过对转基因植株进行转录组测序，分析IbSLF基因可能调控的下游基因及参与的信号通路，同时利用交联质谱技术对其互作蛋白进行分离，用以解析IbSLF基因调控甘薯种内杂交不亲和性的分子机制，为甘薯种内杂交不亲和性的克服及分子机理的进一步研究提供基础。

杂交育种是甘薯育种的主要方式，种内杂交不亲和性严重限制了甘薯的育种进程，对其分子机制的研究将对甘薯种内不亲和性的克服具有重要的意义。基于前期转录学分析发现IbSLF（Tai6.31352）基因对甘薯种内杂交不亲和性的调控可能具有重要作用，其基因表达与种内杂交亲和性呈高度正相关，为此本项目针对IbSLF（Tai6.31352）基因开展功能研究，对其进行了基因分离克隆、不同组织部位表达量测定、亚细胞定位及甘薯遗传转化研究。通过基因分离克隆获得IbSLF（Tai6.31352）基因DNA及cDNA均为1365bp，无内含子，蛋白序列中含有保守的F-box蛋白结构域，表明该基因为典型的F-box家族基因。对其进行表达量测定，显示该基因在亲和授粉花柱中表达量显著高于其他组织部位。亚细胞定位结果显示IbSLF（Tai6.31352）蛋白定位于细胞核及细胞膜中，表明其在细胞膜及细胞核中均有一定的功能作用。为了对其基因功能进行进一步探索研究，利用其cDNA及DNA序列构建过表达及CrispR载体进行甘薯遗传转化，通过甘薯遗传转化获得IbSLF（Tai6.31352）Crisp转基因植株，但未获得过表达载体转基因植株，原因为过表达载体在抗性愈伤分化中常出现褐化死亡现象，推测可能与其参与甘薯育性调控功能相关。对其转基因植株进行抗性基因潮霉素基因（HYG）及IbSLF（Tai6.31352）基因表达量检测，显示在IbSLF（Tai6.31352）Crisp载体及空载（1301）转基因植株均有潮霉素基因的高亮表达，但在野生型植株中未见表达，表明载体已经成功转录甘薯植株体内，同时IbSLF（Tai6.31352）荧光定量检测显示，（Tai6.31352）Crisp转基因植株中表达量显著低于1301及野生型植株，表明IbSLF（Tai6.31352）基因在（Tai6.31352）Crisp转基因植株中受到明显的抑制作用，转基因植株的获得为IbSLF（Tai6.31352）基因在甘薯种内杂交不亲和性的功能作用研究提供了基础。项目的研究结果将为甘薯种内杂交不亲和性分子机制的进一步研究提供参考依据，同时将为不亲和性的克服及其在甘薯育种中的应用提供理论基础。