水稻高叶绿素含量基因Gc的克隆与功能解析

叶绿素是高等植物进行光合作用的重要物质因子,在光合作用的光能吸收、传递和转换中起重要作用。在前期研究中，发现一株水稻高叶绿素突变体，其叶绿素b含量比野生型高1倍以上，遗传研究表明该性状为显性单基因（命名为Gc）控制，目前已将Gc定位于水稻第1染色体87kb的片段上，为克隆Gc基因奠定了基础。本项目拟在现有基础上，克隆水稻高叶绿素含量基因Gc，鉴定Gc与水稻叶绿素b含量的关系；从基因的亚细胞定位和时空表达模式、基因在转录水平的调控及与Gc产物互作蛋白等方面全面分析Gc基因的功能；通过比较Gc突变体与野生型叶绿体的超微结构、叶绿素前体物质的合成动态、其它叶绿素合成相关基因的表达量、叶绿体类囊体膜的蛋白质组学等方面来探索高叶绿素Gc突变体高光效的分子机制。该研究在理论上对于全面了解植物光合作用的分子机制有重大意义；在实践上对于水稻乃至其他禾本科作物的高产优质育种具有重大的经济价值。

1. 克隆了水稻高叶绿素含量基因Gc，序列分析表明该基因为植物基因DET1的同源物（命名为OsDET1）。.2. 序列分析显示，在突变体(Gc)中，OsDET1的突变发生在两个位置：第7个外显子上983位的T突变为C，导致氨基酸由亮氨酸(Leu)突变为丝氨酸(Ser)；在启动子区域-214及-647bp两处处分别有11个碱基片段的插入，而在-272bp处有26个碱基片段的缺失。初步推断，氨基酸序列的改变导致了OsDET1蛋白性质发生变化，而启动子区域的突变改变了该区域的顺式作用元件，从而造成突变体(Gc)和野生型启动子的启动能力差异；.3. 通过互补实验表明：OsDET1的突变(包括启动子插入缺失突变及编码区单碱基突变)的引起了水稻叶绿素b含量的提高。.4. 时空表达分析结果表明：OsDET1在水稻的四个生育期苗期、分蘖期、扬花期及成熟期表达量均比较高，且主要集中在水稻的绿色组织（叶片和叶鞘）表达；OsDET1在突变体(Gc)中表达量显著高于在野生型中的表达量，推测其参与水稻的光合作用。此外OsDET1表达特征具有节律性。.5. 洋葱表皮的亚细胞定位结果表明：OsDET1定位于细胞核。.6. 蛋白互作的初步研究表明，与OsDET1互作的蛋白是光系统II参与光合作用的蛋白如铁氧还蛋白质、体蓝素及泛素等。已有报道铁氧还蛋白及质体蓝素是植物光合作用中的关键蛋白；而泛素参与植物的光损伤修复。.7. 调控序列结果表明：启动子区域的插入及缺失突变导致了启动子的启动能力增强；.8. 突变体(Gc)高光效的分子机制表明：与野生型相比，高叶绿素突变体(Gc):(1)叶绿素b含量及叶片的净光合速率显著增高，气孔导度显著降低；(2) PSII的荧光参数均升高；(3)叶绿体中的基粒类囊体垛叠明显增厚，有的基粒类囊体有膨大现象，说明突变体(Gc)的类囊体膜的装配可能发生了改变；(4)叶片中δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、胆色素原(PBG)，尿卟啉原III(UrogenIII)及粪卟啉原(CoprogenⅢ) 含量增加；(5)叶片中叶绿素a/b结合蛋白基因（CAB1R和CAB2R）、镁螯合酶基因CHLH和谷氨酸-tRNA还原酶基因HEMA1表达增高；(6) PSI反应中心PsaA和 PsaB亚基, PSII 47 kDa蛋白,、43kDa蛋白及PsaA表达量显著增加