大豆RAV基因参与光周期和细胞分裂素信号传导途径调控机理的研究

Soybean is a photoperiod-sensitive short-day plant, which narrowed the adaptability of soybean vairiety. Meanwhile, genetic transformation efficiency of soybean is low due to the difficulty of differentiation and regeneration of soybean cell or tissues. Therefore, identification of new photoperiod and shoot rengeneration-related genes will have important research meanings. The objectives of the present work aimed to discover gene functions of other three RAV gene family members related to photoperiod and shoot rengeneration. The characteristics of time and spatial expression, circadian rhythm and the effect of day-length and cytokinin on gene expression will be clarified. Additionally, the RAV gene function in plants will be determined by over-expression of soybean RAV genes in Arabidopsis and soybean. RNA interfered gene silencing in transgenic soybeans will be further carried out to explain the molecular mechanism in soybean photoperiod and cytokinin pathway, and also evaluating the breeding values in elevating the adaptability of soybean variety for high and stable yield. Finally, genotypes with high regeneration ability would be developed by transfferring RAV gene into soybean cultivars.

大豆属于光周期反应敏感的短日照作物，限制了品种的种植区域；同时，大豆组织分化和再能力较低，导致遗传转化效率低，阻碍转基因研究的进程。因此，鉴定新的大豆光周期和芽再生相关基因具有重要的理论与实践意义。本研究拟深入进行大豆RAV基因功能挖掘，分离克隆出具有重要应用价值的大豆光周期和再生相关RAV基因家族。分析RAV基因在大豆不同发育时期和不同器官内的时空表达特性，昼夜表达方式及受不同日长和细胞分裂素诱导的表达情况。一方面，转化拟南芥和大豆进行基因过量表达研究，阐明该家族成员在植物体内的生理功能，获得高再生能力的大豆新种质。另一方面，在大豆中进行RAV基因的RNA干涉研究，进一步探讨RAV基因家族参与光周期调控开花和细胞分裂素信号的分子机理，确定其在信号传导网络途径中的位置；同时，评价RNAi转基因大豆在提高适应性、促进高产和稳产上的育种价值。

大豆属于短日照植物，其生长发育对光周期反应非常敏感，并且大豆的再生困难，并且难以转化。这一特性严重阻碍了大豆品种的适应性和大豆转基因的效率，这些都是制约大豆单产提高的关键因素。本研究的宗旨是通过选择有利的目的基因，对其进行克隆和定向改造进而转化大豆，试图从根本上改变大豆对光的敏感性以及大豆的再生效率，为提高大豆的单产和培育转基因材料提高寻找新的突破口，从根本上扭转我国大豆依赖于进口的被动局面。为了打破大豆种植区域的局限性，我们通过PCR技术克隆了大豆光周期敏感的转录因子GmRAV1基因，通过PEG法转化拟南芥原生质体来观测GmRAV1-GFP融合蛋白的定位。通过转化短日照大豆和长日照拟南芥，将构建好的植物过量表达载体和植物干涉载体通过农杆菌介导法导入大豆DN50，将过量表达载体通过花絮浸泡法导入拟南芥Columbia-0品种，同时购买T-DNA插入导致的拟南芥rav突变体获得再生功能增强和光周期敏感性增加的大豆新材料，进行再生和光周期反应的功能验证，分别证实了GmRAV1基因是光周期响应基因，能够抑制植物开花。同时它也是细胞分类素促进植物细胞分裂和再生途径中的正调节因子，能够促进细胞分裂，提高植物的再生能力；同时也是细胞分裂素抑制植物根和下胚轴伸长途径的正调节因子，能够抑制植物根和下胚轴伸长。另一方面，分析该类基因在光周期反应中的作用，通过Real-time PCR确定GmRAV1基因在光周期中的表达规律以及观察转GmRAV1基因过量表达大豆、转GmRAV-i基因干涉大豆和对照大豆的表型，进而确定该基因为光周期控制开花途径和植物生长发育过程中的关键抑制因子。通过Real-time PCR详细地研究外界环境如光周期生物钟节律、外源激素等对GmRAV1转录因子基因表达的影响以及分析GmRAV1基因在大豆的根、茎、叶、花和种子中的表达情况。通过对转GmRAV1-ox基因大豆和对照DN50进行转录组测序，对结果进行GO基因注释和Pathway信号通路分析进而获知显著的差异表达基因，确定GmRAV1基因行使其功能所依赖的生物途径为GA信号、GA生物合成、细胞分裂素信号、光周期生物钟等复杂的网络来调节植物营养生长和生殖生长以及二者之间的转换。