新型苦参碱衍生物的分子优化合成、杀虫活性构效关系及机理研究

This project firstly designs a group of optimizing matrine derivatives through choosing heterocyclic groups to substitute 13- or 14-position and using computer aided simulation technique, in which matrine is used as lead compound and the structure of deritatvies is determined by Spectral methods ; and then, studys the insecticidal activity of derivatives against different agricultural pest by cytotoxicity and living pest test, through which screens high activity derivatives to deferent agricultural pests and analyzes its insecticidal structure-activity relationship; at last, conducts qualitative and quantitative analysis of effect of matrine on key gen and protein expression of insect apoptotic cell in pest tissue by using microscopy technique, western blotting, RTQ-PCR;clarifies the insecticidal mechanism of matrine and its deritatives and seeks the molecular targets through revealing activation mechanism of derivatives on apoptotic signal pathway. The project results not only screen some matrine derivatives, which can be used as candidate compounds during the exploitation of new matrine-type insecticide, but also contribute to lay the deep theoretical foundation for designing more novel structure matrine-type insecticide due to the clarification of molecular targets and analysis of insecticidal structure-activity relationship. The innovations in this project mainly reflect in the acquirement of high insecticidal activity matrine derivatives through choosing heterocyclic groups to substitute 13- or 14-position, the construcion of insecticidal structure-activity relationship, and the relative systematic research on insecticidal mechanism targeting important agricultural pest.

本项目首次以苦参碱为先导化合物，选用杂环基团引入13或14键位，利用计算机辅助技术设计合成一批优化的新型苦参碱衍生物，并运用波谱学方法鉴定其结构；然后，通过细胞毒力和活体昆虫试验，分析衍生物对不同农业害虫的毒杀活性，筛选活性显著的衍生物。根据活性数据分析其杀虫活性的构效关系；最后，通过显微镜技术、免疫印迹和RTQ-PCR等定性和定量技术分析苦参碱及其衍生物对昆虫细胞凋亡关键基因和蛋白表达的影响。通过揭示苦参碱及其衍生物激活细胞凋亡信号通路的机制，解析其杀虫机理，明确作用分子靶标。项目结果不仅筛选出可用于开发新型苦参碱杀虫剂的候选化合物，而且通过分析其构效关系和探寻其靶标分子为设计更多结构新颖的苦参碱类杀虫剂分子提供深层次的理论依据。本项目着重如下创新性探索：选用杂环基团修饰苦参碱13或14键位以获得高杀虫活性的衍生物；构建其杀虫活性的构效关系；针对重要农业害虫进行较为系统的杀虫机理研究。

苦参碱因其具有丰富的药理活性和农用活性，成为重要的传统中草药和生物农药。加快其农用和医用应用价值的发掘，开发高效新型苦参碱类农药或医药具有重要科学意义。本项目开展了以下几方面研究：（1）以构建的苦参碱化合物抗癌活性定量构效关系为基础，结合农药分子设计经验，在苦参碱母核 13 键位引入不同的杂环或非杂环活性基团，合成了22个新型苦参碱衍生物，完成结构表征，其中14个化合物获得单晶，根据单晶衍射数据解析了结构。（2）以草地贪夜蛾Sf9细胞和人宫颈癌细胞Hela229为模型，对大部分新合成苦参碱衍生物进行细胞毒力筛选，结果表明苦参碱母核的13键位上引入杂环等活性基团能普遍增强其昆虫和肿瘤细胞毒力，其中引入卤代杂环或在基团与母核间引入硫原子链接其活性尤其明显。（3）以小菜蛾、蚜虫、桑线虫等10余种重要农业害虫为对象，完成了15种新衍生物的虫体活性筛选，发现杂环和卤代杂环苦参碱衍生物对蚜虫，桑线虫活性较高，在部分杂环基团与母核13键位间引入硫原子链接，能够进一步增强衍生物细胞毒力及其杀虫活性。筛选出对蚜虫和桑线虫毒杀活性突出的化合物各6个（校正死亡率80%以上）。（4）形态学分析表明杂环基苦参碱衍生能够通过诱导昆虫细胞凋亡抑制细胞增殖，而环己胺基苦参碱等非杂环基苦参碱则是诱导昆虫细胞原位空泡化，逐渐解体，抑制细胞增殖。肿瘤细胞在苦参碱衍生物作用下则趋于原位空泡化，逐渐解体。（5）以Sf9细胞为材料克隆了草地贪夜蛾组织蛋白酶B和L的基因，预测了两蛋白酶三维结构，制备了组织蛋白酶L的多克隆抗体。（6）合成了苦参碱分子印聚合物微球材料，以其构建苦参碱和氧化苦参碱的分离纯化方法。制备了苦参碱聚乳酸微球缓释载体及性能检测。. 本项目研究结果为苦参碱类环保农药的研发提供候选化合物及相关技术，也为深入研究苦参碱类化合物杀虫机理奠定基础。同时，项目新衍生物修饰合成方法及其抗肿瘤和抗菌活性分析可为以苦参碱类新药设计和开发提供思路。