典型酸性土壤中氨氧化古菌产生氧化亚氮的分子机制

Previous studies suggest heterotrophs are the main microbial source of nitrous oxide production. It has been proved that acidophilic ammonia-oxidizing archaea (AOA) dominates the nitrification in acid soils and its pure culture and enrichments perform high acitivity of nitrous oxide production. However, no direct evidence has been provided that AOA generates N2O in situ soils to date. Here, we’d like to explore the molecular mechanisms of ammonia-oxidizing archaea involved in the production of nitrous oxide in acidic soils based on the gene makers of putative archaea nirK and amoA. First, the distribution and diversity of nirK gene will be surveyed among lots of acidic soils of geographical differences in China by real-time PCR and pyrosequencing. Sencond, the importance of archaeal nirK and amoA genes to N2O production will be explored by the 15N isotope tracer tequnique combined with molecular analysis. Third, we’d like to identify the active ammonia-oxidizing archaea involved in nitrous oxide emission by Stable Isotope Probe tequnique (DNA-SIP) . The genome information of active ammonia-oxidizing archaea will be unveiled though the whole genome sequencing of 13C-DNA. The potential of nitrous oxide production will be confirmed if nirK gene is found in the genome of active ammonia-oxidizing archaea. All findings will contribute to the understanding of the physiological and ecological function of archaea and global nitrogen cycle.

已有大量研究推测异养微生物是酸性土壤中N2O的主要排放源。嗜酸氨氧化古菌的发现，表明古菌是酸性土壤硝化过程的主要驱动者，且在实验室条件下被证实具有较高的N2O产生活性。但迄今为止尚无直接证据表明氨氧化古菌与原位土壤N2O产生有关。本项目以产生N2O关键的氨氧化古菌特异反硝化nirK和氨氧化amoA基因为分子标靶，针对我国大量的酸性土壤，首先运用荧光定量PCR和高通量测序技术对nirK基因开展多样性调查，阐明氨氧化古菌nirK基因在酸性土壤中的分布规律；再通过15N示踪法研究氨氧化古菌nirK和amoA基因对N2O产生的指示意义；最后利用“13C-稳定同位素核酸探针”技术，在分子水平示踪N2O排放过程中的氨氧化古菌作用者，进一步通过全基因组测序寻找活性氨氧化古菌中nirK及其他反硝化基因，揭示氨氧化古菌产生N2O的遗传代谢途径。该研究有助于深化对酸性土壤微生物驱动氮循环的认知。

氨氧化古菌(AOA)被认为是酸性土壤硝化过程的主要驱动者，且在实验室条件下被证实具有较高的产N2O活性。但迄今为止尚无直接证据表明氨氧化古菌与原位土壤N2O产生有关。本项目通过一系列分子生物学实验，试图阐释氨氧化古菌在酸性土壤硝化及N2O排放过程中的重要生态功能。通过开展amoA和16SrRNA基因调查，发现我国8种酸性土壤中氨氧化古菌均高于氨氧化细菌(AOB)，且有机质和铵态氮含量分别是影响AOA和AOB数量的最主要因子，有机质含量与AOA正相关，而铵态氮含量与AOB负相关。以特定酸性土壤为例，利用稳定同位素示踪和高通量测序技术，揭示了Nitrosospira 属AOB在施肥土壤硝化和N2O排放中的主导作用，相对贡献大于95%；而Group1.1a-associated AOA在不施肥土壤活性较高，但总排放量较低。表明在不受干扰的原位酸性土壤中AOA可以利用矿化出的氨进行低水平的氨氧化及N2O排放。将DNA和rRNA水平土壤微生物群落进行比较，发现rRNA水平氨氧化细菌丰度高于DNA水平，氨氧化古菌丰度远远低于DNA水平，表明RNA研究更能反应氨氧化微生物的活性，而DNA研究反应其种群的多样性。新鲜土与风干土比较，发现土壤风干依然能够保留新鲜土壤DNA中氨氧化群落差异。微生物介导的碳氮循环十分复杂、密不可分，本项目研究还发现土壤引入外源碳源及氮肥，能够刺激土壤N2O的排放，但与氨氧化古菌的关系不明显；大气CO2升高对草地生态系统酸性土壤中整体微生物群落及氨氧化微生物不会造成显著性分异。本项目有助于深化对酸性土壤微生物驱动氮循环的理解，且为土壤微生物生态学研究提供了技术支持。在国家自然科学基金青年项目的资助下，本课题组发表了一区TOP期刊SCI论文一篇，其他论文也将相继刊出。