抗CD20单克隆抗体及IL-10基因联合免疫治疗对胰岛β细胞保护作用及机制研究

1型糖尿病（T1DM）免疫治疗日益受到重视，动物模型和临床研究均显示，多种免疫干预方法可以保护胰岛β细胞，阻止甚至逆转新发生的T1DM。但迄今已完成的单药免疫干预结果并不满意，其原因可能是免疫制剂的最大耐受剂量限制和β细胞免疫损伤存在多种致病途径。因此免疫制剂联合治疗是在该领域取得突破的新途径。抗CD20单克隆抗体清除B淋巴细胞，在动物实验和临床观察中均取得保护胰岛β细胞的效果，但可引起IL-10下调。我们此前已经证实IL-10具有胰岛β细胞保护作用，因此设想将抗CD20单克隆抗体与IL-10基因联合干预NOD鼠，一方面减少免疫调节剂的毒副作用，另一方面通过多种途径实现免疫调节。观察此联合免疫疗法保护胰岛β细胞的效果，通过观察CD4+CD25+Treg细胞、CD4+T细胞及B细胞重建变化，探讨联合免疫治疗的细胞分子机制，为今后T1DM的免疫干预提供新思路。

T1D是一种以胰岛β细胞进行性损伤、内源性胰岛素分泌绝对不足为主要表现的自身免疫性疾病。目前研究发现，Th1/Th2细胞亚群失衡和B淋巴细胞的过渡激活是其发病的重要机制。CD20是B细胞重要的表面分子，抗CD20单克隆抗体可以诱导B细胞的免疫性耗竭。本实验利用抗CD20单克隆抗体阻断B细胞作用，同时利用腺病毒介导的IL-10基因恢复Th细胞亚群比例，以期观察联合治疗对未发病NOD鼠T1D的预防作用。.本实验成功构建携有鼠IL-10基因的重组腺病毒载体。并证实，该重组腺病毒不影响胰岛β细胞的正常生理功能，且可以在细胞中持续表达，转录翻译成IL-10。IL-1β是诱导胰岛β细胞凋亡的重要细胞因子，本实验通过体外及体内实验均证实IL-10可以通过抑制Fas表达，抑制caspase凋亡通路，抑制NO、NOS合成等方式，降低胰岛β细胞的凋亡。实验利用HE、TUNEL染色、免疫组化、ELISA、PCR、western blot等多种方法，研究抗CD20单克隆抗体与IL-10联合干预对NOD鼠T1D的预防作用时发现：联合干预可降低NOD鼠T1D的发病率，促进胰岛素的分泌，控制血糖，减轻胰岛炎，并通过抑制Fas表达，阻断caspase-8、caspase-3凋亡通路，激活Bcl-2抗凋亡通路，发挥对胰岛β细胞的保护作用。同时发现联合干预，可上调PDX-1基因表达，促进胰岛β细胞的分化和增殖。总之，CD20单克隆抗体与IL-10基因联合干预，对NOD鼠T1D的发生起到一定的预防作用。