小麦蓝矮植原体全基因组序列测定与功能注释研究

植原体是一类重要的农业有害微生物,专性寄生于植物的韧皮部筛管系统。由于不能人工培养与汁液摩擦接种，获得高纯度的植原体相对困难，致使对植原体全长基因组、功能注释及生理与代谢等缺乏系统研究。随着采用脉冲电泳从病株伤流液中分离植原体染色体DNA技术与高通量DNA测序技术的出现，为全长基因组序列分析与功能注释提供了技术条件。小麦蓝矮植原体(WBD phytoplasma)是我国特有种类，引起小麦蓝矮病。本课题拟采用脉冲电泳技术分离WBD植原体基因组DNA，利用新一代solexa测序技术测定全基因组序列，绘制出我国首例植原体全基因组图谱；在此基础上进行编码区（CDS）预测与功能注释，结构特性分析，图解植原体细胞生理与代谢过程、侵染致病过程。本研究既是本学科的重要理论问题，也将为利用靶标基因防治我国农林、园艺作物等的植原体病害探索新途径。

小麦蓝矮病是我国冬麦区小麦的一种重要病害，曾在西北地区大面积流行危害，造成严重的经济损失。其病原为小麦蓝矮(WBD)植原体，由条沙叶蝉专化传播。目前，植原体尚不能人工培养，其基因组的获得对研究WBD植原体致病机理显得尤为重要。本课题组首先将WBD植原体接种传播到繁殖寄主长春花上，以感染WBD的长春花为材料，通过差速离心和脉冲电泳的方法，成功分离到了WBD植原体基因组DNA，并通过PCR和southern blot验证，其大小约为650kb。其次，通过基因组扩增技术对WBD基因组DNA进行扩增，获得了大约40微克的基因组DNA，以用于基因组序列测定。最后，采用solexa高通量测序技术对WBD基因组DNA进行测序，总共获得14,381,525,402 bp序列。通过CLC genomic work bench对这些序列进行组装，最终得到14个与已公布的翠菊黄化（AY）植原体基因具有同源性的contigs。这14个contigs总大小为645725 bp，占WBD基因组99.3%。对得到的14个contigs进行生物信息学分析，表明这14个contigs含有875个ORF，其中编码237个膜蛋白，28个分泌蛋白和20个tRNA。对编码的蛋白进一步分析表明，WBD植原体体内糖代谢相关途径较完整，而脂类、蛋白和核酸代谢途径有缺失。本课题得到的WBD基因组序列将为研究WBD植原体的致病机理和灾变机制奠定坚实的基础，也为利用靶标基因防治我国农林、园艺作物等的植原体病害提供了方向。