猪卵泡在闭锁过程中颗粒细胞内BimEL磷酸化修饰位点的变化规律及主要调控路径

This project will focus on phosphorylated modifications of BimEL in porcine granulosa cells during follicular atresia and their regulating pathways. Firstly, phosphorylation sites of BimEL in porcine follicular granulosa cells from healthy, slightly atretic and atretic follicles with the same diameters will be analyzed by LC MS/MS respectively to find different phosphorylated sites, and their upstream molecular pathways will be predicted by bioinformatics methods. Then, overexpressions of wild-type and different phosphomutant BimEL will be performed in bim-/- porcine fetus fibroblast cells and bim-/- COV434 cells to determine their functions in cell survival, proliferation and apoptosis. Based on the above results, the specific antibodies to functional phosphorylated BimEL will be prepared. Next, RNAi, Western blot assay, signaling pathway activators and inhibitors will be used to decipher molecular pathways regulating different BimEL phosphorylations in the above bim-/- cells, which will be further confirmed in in-vitro cultured follicles treated by FSH, IGF-1 or heat stress. Finally, immunohistochemistry detection and Western blot assay will be carried out to validate the relationship between follicle health status and expressions of different phosphorylated BimEL in granulosa cells from ovarian tissues. The results are anticipated to elucidate the physiological functions of BimEL phosphorylations during follicular development, and may provide novel targets for new drugs and techniques designs to control follicular development in mammals.

本项目将探索猪卵泡在闭锁过程中颗粒细胞内BimEL磷酸化位点的变化规律及其调控机制。首先，用飞行质谱技术分别检测相同直径健康、轻度闭锁和闭锁卵泡中颗粒细胞内BimEL的磷酸化位点，经生物信息学比对，筛选差异位点，并预测其功能和上游调控机制。然后，在bim-/-猪胎儿成纤维细胞和人COV434细胞中，通过BimEL超表达和点突变，结合细胞凋亡与增殖检测技术，确定具有生物学功能的磷酸化位点，并制备相应抗体。再以bim-/-细胞为材料，运用Western blot和RNAi技术，结合细胞通路调控剂，解析引起不同磷酸化修饰的分子路径，并在FSH、IGF-1和热应激处理卵泡中确认。最后，运用免疫组化和Western blot技术验证卵巢颗粒细胞中不同磷酸化修饰BimEL水平与卵泡健康状态的关系。研究结果将明确BimEL磷酸化修饰在卵泡发育中的功能，为家畜卵泡发育调控技术或药物研发提供新的理论依据。

本课题探索了猪卵泡在闭锁过程中颗粒细胞内BimEL关键磷酸化修饰位点变化及其调控通路。研究发现，猪卵泡颗粒细胞中BimEL磷酸化修饰模式和水平与闭锁状态密切相关。FSH、IGF-1通过激活ERK通路上调p-BimEL-S65水平，加剧BimEL降解，促进颗粒细胞存活和卵泡发育，同时褪黑素通过上调磷酸化BimEL的泛素化降解参与卵泡健康状态的维持。相反，环境热应激通过激活JNK通路上调p-BimEL-T112水平，诱导生长卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。另外，课题组用LC-MS/MS技术全面分析了猪卵泡从健康、轻度闭锁到闭锁过程中颗粒细胞中蛋白质和蛋白质磷酸化修饰的变化。总共鉴定到了7104种蛋白质，其中6201种被定量分析，与闭锁卵泡相比，健康卵泡中有29种上调、21种下调，且差异倍数在5以上；鉴定到2830种蛋白质的6839个磷酸化位点，定量了其中1760种的4723个磷酸化位点，与闭锁卵泡相比，健康卵泡中39个位点上调、26个下调，且差异倍数在7以上。通过GO功能聚类和KEGG通路分析，发现了诱发颗粒细胞凋亡的主要功能蛋白质、关键磷酸化位点、主要生化过程和重点调控通路，并从转录因子和蛋白激酶角度对关键通路作了深入分析。同时，对MIF（巨噬细胞迁移抑制因子）在猪卵泡细胞中的分布和p-caspase6-S76磷酸化位点在细胞凋亡中的功能进行了深入研究。课题组首次从关键促凋亡蛋白的磷酸化修饰角度对动物卵泡的闭锁机制进行了诠释，同时，建立了哺乳动物卵泡闭锁过程中颗粒细胞的蛋白质变化数据库和蛋白质互作全景图。这不仅为动物卵泡闭锁机制的后续探索提供了蛋白质数据平台，也为卵泡体外培养、辅助生殖、人类卵巢早衰和生育力保存等技术的研发提供明确的理论指导。相关研究结果已SCI期刊发表研究论文6篇，其中3篇影响因子大于5.0；在本课题资助下4名硕士生和3名博士生完成了学位论文；有关IGF-1和MIF的研究结果正在向动物生产和人类妇产科临床进行转化研究。