FGF8通过Ras/MEK/ERK信号通路调控apical ES结构影响精子生成的机制研究

Declined male semen quality has become a growing international health concern. The applicant’s previous FGF8 transgenic mice showed an oligospermia and infertility. However, the role of FGF8 in spermatogenesis is still unclear. Previous results indicated that the apical ES structure was impaired. Meanwhile，the apical ES related protein were regulated by FGF8 and the Ras/MEK/ERK signaling pathway was abnormally activated at the same time. We hypothesize that FGF8 regulates apical ES through the Ras/MEK/ERK signaling pathway and therefore affects spermatogenesis. To test this hypothesis, we transplant GFP labeled spermatogonia to the testis of FGF8 transgenic mice, using electron microscopy, immunostaining to evaluate the junction between spermatids and Sertoli cells; at the same time, we co-culture Sertoli cells and germ cells, using FGF8, FGF8 receptor inhibitor and ERK inhibitor to intervene the cells and using western blot, immunostaining, Real-time PCR to evaluate activation of signal pathway and downstream genes expression. By exploring the mechanism of FGF8 regulates spermatogenesis through Ras/MEK/ERK signaling pathway at in vitro and in vivo level, the study will provide theoretical basis for male infertility treatment.

男性精子质量下降已经成为全球关注问题。申请人前期转基因小鼠提示生殖系统高表达FGF8的雄性小鼠精子质量显著降低且不育，目前国内外对FGF8在生精过程中的作用机制尚不明确。动物实验提示高表达FGF8的睾丸组织中，生殖细胞与Sertoli细胞间连接异常，体外实验提示FGF8显著激活Ras/MEK/ERK 信号通路且调节apical ES相关蛋白表达与活化。本项目拟移植GFP标记精原细胞于高表达FGF8小鼠睾丸内，应用电镜，免疫染色评估精子细胞与Sertoli细胞间连接情况；体外培养Sertoli细胞与生殖细胞，应用FGF8及相应抑制剂进行干预，利用western blot，免疫染色，实时定量 PCR，NGS等方法观察信号通路关键因子活化及下游基因表达情况。通过体内外实验探索FGF8通过 Ras/MEK/ERK信号通路调控apical ES结构影响精子生成机制，为治疗男性不育提供理论基础。

在不孕的各种因素中，男性因素占45-50%，各种原因导致的精子发生障碍是男性不育的主要原因。在精子发生过程中，支持细胞间连接的完整性和动态平衡对于生殖细胞跨生精上皮经减数分裂转化为成熟精子并释放至关重要。MMP2是最早发现的由支持细胞分泌的参与生精过程的基质金属蛋白酶之一，其表达异常可能导致精子生成障碍。FGF8主要表达于睾丸和卵巢组织，参与维持生殖系统功能，但目前的具体机制尚不明确。本项目旨在探索FGF8影响精子生成的可能机制。本研究通过分析FGF8过表达转基因小鼠睾丸及附睾组织结构变化发现FGF8过表达小鼠睾丸体积较野生型小鼠小，附睾增大。同时FGF8转基因小鼠睾丸组织生精小管上皮细胞排列紊乱，退化明显，连续性受损，支持细胞上精子细胞或精子附着明显减少，附睾组织中精子明显减少。通过对睾丸组织及体外实验研究提示，MMP2与pFAK在转基因小鼠睾丸组织中表达明显增加， FGF8可能通过FGFR信号通路上调MMP2及pFAK影响生精小管上皮细胞连续性及完整性。对过量暴露于FGF8的小鼠支持细胞进行转录组测序结果提示FGF8可能通过多种途径参与精子生成，如HIF信号通路，Ras信号通路，FGF8也可能通过影响细胞骨架蛋白、细胞外基质和细胞局部粘连影响精子生成，这与我们预期的结果一致。课题组同时探索较为适宜的小鼠睾丸生精细胞冷冻保存方案，从多个方面寻求增强男性生育力的可能，结果显示不同冷冻保护剂对小鼠睾丸生精细胞冻存效果有显著影响，其中含有10%DMSO，0.1% mol/L蔗糖，0.1% mol/L 海藻糖及10% HBS的冷冻方案是冻存小鼠睾丸生精细胞较适合的冷冻保护剂方案。本项目针对FGF8调控精子发生的机制进行研究及对生精细胞冷冻保存方案的探索，为提高男性生育能力的方案提供可靠的理论依据。