G蛋白偶联受体激酶2非受体依赖功能调控心肌细胞凋亡的研究

G蛋白偶联受体激酶 (GRKs) 是调节G蛋白偶联受体 (GPCR)最重要的分子。它能特异地使活化的GPCRs发生磷酸化, 从而终止GPCRs介导的信号转导通路。心脏内主要存在的GRKs亚型是GRK2，它通过使β-肾上腺素能受体（心脏GPCR重要成员）磷酸化与脱敏，造成细胞内信号传导通路受阻。在预实验中我们发现，GRK2不仅表达于胞浆，也表达于心肌细胞线粒体，并且在凋亡状态下表达增高；如果抑制心肌细胞中的GRK2表达，则会减少线粒体中GRK2水平，并显著抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡。因此我们认为GRK2可能通过直接调节线粒体功能对心肌细胞凋亡产生调控作用。本研究拟采用病毒感染和SiRNA手段，上调或下调心肌细胞内GRK2水平，综合运用细胞学、组织学及分子生物学研究方法，明确其对心肌细胞凋亡的影响；并通过对线粒体结构和功能及相关蛋白的研究，探讨GRK2向线粒体转运在心肌细胞凋亡中的作用。

G蛋白偶联受体激酶 (GRKs) 是调节G蛋白偶联受体 (GPCR) 最重要的分子。心脏上主要存在的GRKs亚型是GRK2，它通过使β-肾上腺素能受体（心脏GPCR重要成员）磷酸化与脱敏，造成细胞内信号传导通路的受阻。我们首次发现除胞浆外，在细胞线粒体中也有GRK2表达，并且在凋亡状态下其表达增高，推想GRK2可能通过直接调节线粒体功能从而对心肌细胞凋亡产生调控作用。本研究采用分离的小鼠心肌细胞，使用病毒感染和SiRNA的手段，上调和/下调或心肌细胞内的GRK2表达，结果显示：当心肌细胞胞浆内的GRK2水平上调时，心肌细胞线粒体内GRK2的表达同时升高；当心肌细胞胞浆内的GRK2水平下调时，心肌细胞线粒体内GRK2的表达随之降低。正常心肌细胞在凋亡状态下，线粒体内GRK2的表达显著升高。GRK2上调的心肌细胞在凋亡状态下，线粒体内GRK2的表达升高幅度大于正常心肌细胞，H2O2诱导更多心肌细胞发生凋亡；GRK2下调的心肌细胞在凋亡状态下，线粒体内GRK2的表达未见显著升高，H2O2对心肌细胞的凋亡作用显著减少。我们的研究证实，GRK2可与伴侣蛋白热休克蛋白90 (HSP90) 发生免疫共沉淀，是通过与其结合而被转位至线粒体内。当心肌细胞在凋亡状态下，线粒体内的HSP90表达升高与GRK2平行，线粒体中GRK2表达升高可抑制线粒体呼吸功能，显著减少线粒体的ATP生成。HSP90抑制剂格尔德霉素（geldanamycin，GA）可以抑制HSP90与GRK2的结合，减少凋亡状态下GRK2向线粒体的转位，保护线粒体功能，维持线粒体的ATP生成。综上所述，我们的研究证实了除胞浆外，心肌细胞线粒体中也存在GRK2，它是通过与伴侣蛋白HSP90结合而被转位至线粒体中，在凋亡状态下，更多的GRK2被转位至线粒体中，抑制线粒体呼吸功能，显著减少线粒体的ATP生成，促使更多心肌细胞发生凋亡。过表达胞浆内的GRK2会提高线粒体中GRK2水平，促进心肌细胞凋亡；而减少胞浆内的GRK2的表达和抑制HSP90与GRK2的结合，可减少GRK2向线粒体的转位，降低线粒体内GRK2水平，保护线粒体功能，维持线粒体的ATP生成，减少心肌细胞凋亡的发生。本研究的发现对GRK2在心脏功能调控中的作用产生全新的认识，为进一步寻找有效的抗凋亡手段而逆转心肌重塑，开启心衰治疗的新策略提供了新的思路。