拟南芥CHIL蛋白调控类黄酮生物合成的分子机制研究

As one of the largest groups of secondary metabolites in plants, flavonoids play important roles in plant growth and development as well as human health. But many questions are still unanswered in the biosynthesis and regulation of flavonoid biosynthetic pathway. Among them, the role of chalcone isomerase-like protein is still uncharacterized. We found the contents of flavonoids (mainly condensed tannins and flavonols) are affected greatly by CHIL in Arabidopsis. The CHIL protein does not have any catalytic activity, and it could not regulate the expression of other genes at transcript level. Therefore, we propose that CHIL regulates the activity of TT5 at post-translational level, and it may also act as anchor protein to regulate different branch in the flavonoid pathway. In the present study, we expect to verify the interaction between CHIL and TT5 by using yeast two hybrid and bimolecular fluorescence approaches. We expect to clarify the regulation of CHIL on TT5 activity by using western blotting approach, to identify target proteins of CHIL by using Co-immunoprecipitation approach. We are aiming to finally characterize the molecular mechanism of CHIL on regulating flavonoid biosynthesis. This study will further improve our understanding on the mechanism of flavonoid biosynthesis and regulation, which will also benefit plant breeding with flavonoids-related quality.

类黄酮是一大类对植物生长发育和人类健康都十分重要的植物次生代谢产物，但是类黄酮生物合成和调控的许多分子机制还不完全清楚。其中类查尔酮异构酶（CHIL）的功能一直都是未知的。我们研究发现，拟南芥CHIL蛋白显著影响类黄酮分支产物缩合单宁和黄酮醇的含量，CHIL不具有酶蛋白的催化活性，也不能在转录水平调控其它基因的表达水平，推测CHIL可能在转录后水平调控TT5蛋白的活性，同时CHIL也可能作为锚定蛋白调控不同分支途径酶蛋白的活性。本项目中，我们拟采用酵母双杂交和双分子荧光的方法验证CHIL与TT5蛋白的相互作用，通过Western blotting和酶活分析的方法检测CHIL对TT5的蛋白表达水平和活性的影响，通过Co-IP鉴定CHIL调控的分支途径蛋白，以期最终揭示CHIL调控类黄酮生物合成的分子机制。本研究将有助于进一步解析类黄酮的生物合成和调控，有助于对植物进行类黄酮相关的品质改良。

类黄酮是一大类对植物生长发育和人类健康都具有重要作用的植物次生代谢产物，但是类黄酮生物合成途径及其调控过程中的许多分子机制还不完全清楚。其中植物的类查尔酮异构酶基因（CHIL）的功能还是未知的。本项目首次以模式植物拟南芥为研究对象，分析了使用35S启动子和CHIL自身启动子驱动的chil背景下的互补材料，以及由35S启动子和TT5自身启动子驱动的tt5背景下的突变体材料，发现CHIL影响但并没有阻断拟南芥中主要类黄酮的生物合成途径，并且CHIL的作用并没有TT5的作用明显。研究发现，拟南芥的CHIL蛋白主要显著影响类黄酮中分支产物黄酮醇和缩合单宁的含量，但是CHIL并不具有类似TT5的催化类黄酮化合物作为底物的活性。本项目还采用酵母双杂交的方法确认了CHIL可以与TT5蛋白相互作用，同时还采用双分子荧光实验方法验证了CHIL与TT5蛋白在体内存在相互作用，但是双分子荧光的信号较弱，说明两者之间的相互作用较弱。本项目创制了分别含有不同标签FLAG和MYC蛋白的CHIL和TT5的过量表达植株，筛选了表达量高的植株进行了双杂交，创制了含有FLAG和MYC双标签以及CHIL和TT5双目标蛋白的关键材料，通过对这一材料以及与其它11种不同对照材料在基因表达水平、蛋白表达水平和类黄酮含量的分析，初步的研究结果表明CHIL通过影响TT5的蛋白表达水平而调控分支途径基因的表达水平和蛋白的表达水平，从而影响不同类黄酮分支途径代谢物的积累水平。本研究初步解析了CHIL参与调控类黄酮的生物合成的分子机制，为其它作物类黄酮相关的品质性状的分子改良提供了重要的参考。