农田氨氧化古菌生理代谢多样性及其单细胞水平的比较基因组学研究

The discovery of ammonia-oxidizing archaea (AOA) was a significant breakthrough in microbial mechanism driving the global nitrogen cycle. However, the physiological characteristics and their potential molecular mechanisms of different lineages of AOA are still elusive, because of the lack of isolation of representative strains and their community diversity. It obstacles the understanding of the ecological functions of AOA in the agricultural ecosystem. Thus, using the combination of microcosm, stable isotope probing (SIP), Raman Active Cell Sorter (RACS) and high-throughput sequencing techniques, we investigate the physiological characteristics of different lineages of AOA, such as heterotrophy/mixotrophy, acidic tolerance, growth temperature range, growth ammonia concentration range, etc. Furthermore, we illustrate the potential molecular mechanisms for these unique physiological characteristics of AOA, based on the single cell comparative genomic analysis. The results will deep our understanding about the physiological and ecological functions of AOA in agricultural ecosystems.

氨氧化古菌(AOA)的发现是最近十年全球氮循环微生物驱动机理研究的重大突破。然而，由于AOA属于"极难培养微生物"，且其群落组成复杂，不同类群AOA生理代谢特征及其分子生物学机制仍不清楚。这极大地制约了对农田等生态系统中AOA生态功能的认识。本项目以我国典型农田黑土、潮土、红壤和水稻土为研究对象，采用微宇宙培养、稳定性同位素示踪（SIP）、拉曼单细胞微流控分选（RACS）和高通量测序等技术手段，探明不同类群AOA营养类型（有机碳利用）、耐酸、生长底物浓度和生长温度等关键生理代谢特征；并通过单细胞水平的比较基因组学研究，初步解析AOA生理代谢特征分异的分子生物学机制。本研究试图阐明农田生态系统中AOA的生理代谢多样性，并注重从基因组角度探讨AOA生理代谢多样性的分子生物学机制，其结果将深化对AOA在农田生态系统物质和能量转化过程中贡献的认识。

氨氧化古菌（AOA）是地球中数量众多和无处不在的一类重要微生物，它在全球海洋和陆地氨氧化过程发挥着主导作用。在陆地上其数量可达到氨氧化细菌的3000倍左右，且生态型复杂，包括：中性类群，嗜酸性类群和耐高温类群等。然而土壤中这些不同生态型AOA生理代谢特征及其物种形成和环境适应性等分子生物学机制仍不清楚。这极大地制约了对农田等生态系统中AOA生态功能的认识。本项目重点围绕农田土壤AOA生理代谢多样性及其物种/生态型形成的分子生物学机制开展研究工作。经过4年的努力，（1）我们建立了耦合13C/15N-DNA-SIP-RACS和MDA以及metagenomics技术的土壤活性氨氧化古菌基因组研究技术平台。该平台为利用单细胞技术研究土壤硝化微生物功能基因组提供了新思路和重要技术支持。（2）通过土壤调节pH，铵态氮和硝态氮检测，DNA-SIP,功能基因amoA的荧光定量PCR和MiSeq高通量测序等手段，我们明确发现1.1b group，即‘土壤类群’中部分类群AOA也能严格嗜酸性生长。这极大的改变了长时间以来，大家认为1.1b group古菌只能中性生长的观点。（3）通过添加和控制水稻土壤中硝态氮浓度并结合DNA-SIP等手段，我们发现一支氨氧化古菌能够在100 mM的高铵浓度下发挥主导作用。这也颠覆了长期以来人们认为AOA只能适应寡营养环境的认识。（4）在以上工作基础上，我们拼接获得嗜酸以及耐高铵的类群的土壤AOA基因组，通过宏基因组以及宏转录组学分析，破译了氨氧化古菌嗜酸类群的嗜酸分子机制及其嗜酸和耐高铵类群物种分化的可能分子生物学机制。这些研究结果极大的丰度了我们对氨氧化古菌环境适应性和物种分化以及多样性的认识，加深了对农田土壤硝化过程微生物学机制的理解。已发表SCI论文一篇，以第一作者第一标准投稿PNAS论文一篇，一篇SCI即将投稿中。