对虾HPV病毒衣壳蛋白前体切割的分子机理及对病毒颗粒形成的影响研究

Hepatopancreatic Parvovirus (HPV) is an economically important pathogen of shrimp. The cleavage of HPV capsid protein precursor might be important for the formation of virus particle, so the study of its mechanism is not only theoretical important but also a useful approach for the study of its infection, immune and drugs. In this research project, we will demonstrate the cleavage mechanism of HPV capsid protein precursor by the following three aspects: 1. the cleavage site; 2. cleavage enzyme; 3. the cleavage cellular process. In order to understand the influence of cleavage to the formation of virus particle, we design and express the whole capsid protein rCPwh and truncated protein rCPpa, preparing VLPs and exploring the effect on particle formation. If the full length protein could not form particles, we further shortened its n-terminal section to find the exact regain affecting the formation of virus particle. And we will express HPV protein rCPwh, rCPpa and VLPs and resolve the protein crystal structure. All the research will provide a detailed understanding of the molecular basis of the mechanisms that underlie the influence of cleavage of HPV capsid protein precursor on the formation of virus particles and its assembling mechanism.

对虾肝胰腺细小病毒(HPV)是对虾的重要病原之一。HPV衣壳蛋白前体切割是病毒繁殖过程的一个重要环节，弄清其切割机制及其对病毒颗粒形成的影响，不仅有重要的理论意义，也有利于将来进一步去研究抗病毒药物和免疫制剂。在本项目中，我们将利用基因工程技术，从3个方面初步揭示衣壳蛋白前体的切割机制：1.切割场所；2.切割的酶；3.切割的细胞生物学过程。同时为了弄清切割对病毒颗粒的形成有什么影响，我们设计全长衣壳蛋白rCPwh和截短蛋白rCPpa，制备病毒样颗粒并探索其对颗粒形成的影响。如果全长蛋白不能形成颗粒，我们进一步对其N端进行分段截短表达，找到影响颗粒形成的蛋白区域。并且我们将对HPV病毒蛋白rCPwh、rCPpa 和病毒样颗粒蛋白晶体结构进行研究，揭示对虾HPV衣壳蛋白前体的切割对病毒样颗粒形成的影响及病毒样颗粒的构成机制。

对虾肝胰腺细小病毒（HPV）是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一，对虾HPV病毒通过衣壳蛋白与机体相互作用而进行感染，是病原学研究的重要内容。本项目根据中国对虾（Penaees chinensis）HPV病毒（韩国株）的基因序列，人工合成衣壳蛋白全长cp基因，生物信息分析表明CP蛋白无信号肽，不是分泌表达，而是在细胞内表达。通过细胞定位预测，发现细胞表达时可能定位于细胞核内，并且蛋白N端和C端分别有一个定位信号。对于蛋白的修饰发现，蛋白可能会有糖基化修饰位点。采用pET-30a和pet22b表达载体全长的CP蛋白（820个氨基酸），发现表达量均比较低且不稳定。为此，我们采用pET-30a表达载体，将对虾 HPV 病毒 CP 蛋白分成了7段，在大肠杆菌BL21中分段表达，研究对虾HPV病毒CP蛋白的不同区段在大肠杆菌中的表达特征是可溶性表达还是以包涵体表达，为病毒样颗粒的制备奠定基础，结果发现CP蛋白的N端部分蛋白能稳定表达，而C端部分不太稳定，而CP蛋白主要集中在C端。为了提高CP蛋白的稳定性，我们将CP蛋白基因克隆到pSUMO载体，转化到Rossetta (DE3) 菌株，与泛素蛋白SUMO融合表达，成功获得纯化的SUMO-CP融合蛋白后，经免疫兔获得抗血清，通过SUMO蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，去除非特异性抗体成分，并进一步通过ELISA和Western blotting对血清效价和特异性进行测定。另外我们研究了CP蛋白在昆虫细胞中的表达。我们完成了Bac-to-Bac® 表达系统构建，构建了HPV-cp重组表达载体，通过免疫荧光等证明其成功表达CP蛋白。利用Bac-to-Bac® 表达系统，将全长的CP蛋白基因克隆到pAcGP67B质粒上，在CP蛋白的N端融合绿色荧光蛋白EGFP，在CP蛋白的C端融合红色荧光蛋白rfp，然后转染昆虫细胞中表达CP蛋白，采用荧光共聚焦显微镜定位CP蛋白在昆虫细胞细胞核中表达。利用pAcGP67B在Bac-to-Bac® 表达系统中表达CP蛋白，其蛋白表达量非常少，无法满足病毒样颗粒制备所需要的蛋白量。