一种新的黑化反应调节酶参与蚊虫抗真菌免疫的机制

Mosquitoes transmit many devastating diseases, such as malaria, dengue fever, and filariasis. Investigation of mosquito immunity will open the door for developing more specific approaches in preventing pathogen transmission by vectors. Melanization, a universal defense mechanism in insects, is medicated by serine protease (SP) cascade. Phenoloxidase (PO), the key enzyme of melanization, is involved in the production of toxic melanin, which is deposited around the pathogens and finally kill them. The entomopathogenic fungus may destroy the humoral immunity by interfering the melanization to escape and suppress the immune attacks of insects. Here, we propose to investigate a serine protease with novel domain structure, CLSP2, in the modulation of melanization and anti-fungal immune response of mosquito, Aedes aegypti. We firstly use western blotting and RNA interference to detect the cleavage of CLSP2 in mosquito hemolymph challenged by fungal and also the effects on melanization, so as to clarify the pathway involved in modulation the melanization. Next, we will use the high-throughput transcriptome sequencing technology (RNA-seq) combined with bioinformatics to analyze the role of CLSP2 in the mosquito anti-fungal immunity-Toll and IMD pathways, identify key anti-fungal factor, and elucidate the molecular mechanisms regulating mosquito CLSP2 anti-fungal immune responses. Through this study, we can make clear the mechanisms about the enzyme involved in modulation melanization and mosquito anti-fungal immunity. This can direct us to find methods to improve effectiveness of fungal insecticides, and also provide a theoretical reference for the design of the new ideas for pest control.

蚊虫是疟疾、登革热和丝虫病等重要虫媒疾病的传播媒介。对蚊虫抵御真菌等病原体免疫应答机制的研究具有重要的理论意义和实用价值。丝氨酸蛋白酶级联介导的黑化反应是昆虫抵御外源病原体的重要机制。虫生真菌可能通过调控黑化反应对体液免疫进行干扰从而达到躲避、压制昆虫免疫攻击的目的。本研究着眼于揭示一个具有特殊结构域构成的丝氨酸蛋白酶CLSP2在调节埃及伊蚊黑化反应和抗真菌免疫中的作用。首先利用免疫印迹和RNA干扰技术研究CLSP2在蚊虫受真菌刺激后血淋巴中的剪切作用及其对黑化反应的影响，从而明确其参与调节黑化反应的途径；其次，利用高通量转录组测序技术探讨CLSP2与蚊虫免疫通路Toll途径和IMD途径的相互作用，阐明CLSP2调节蚊虫抗真菌免疫反应的分子机制。通过本课题的研究明确该酶参与调节蚊虫黑化反应和抗真菌免疫的机制从而找到改进真菌杀虫剂效力的方法，为设计控制媒介昆虫的新思路提供理论参考。

蚊虫是疟疾、登革热和丝虫病等重要虫媒疾病的传播媒介。媒介蚊虫传播的寨卡病毒等疾病对人类公共健康构成严重威胁。而研究发展绿色的新型真菌生物杀虫剂具有重要的理论意义和广泛地应用前景。虫生真菌球孢白僵菌和金龟子绿僵菌被用于媒介昆虫和其他农林昆虫的生物防治，但仍存在不少弊端从而限制了其应用。对蚊虫抵御真菌等病原体免疫应答机制的研究具有重要的理论意义和实用价值。丝氨酸蛋白酶级联介导的黑化反应是昆虫抵抗外源病原体的重要机制。虫生真菌可能通过调控黑化反应对体液免疫进行干扰从而达到躲避、压制昆虫免疫攻击的目的。本研究着眼于揭示一个具有特殊结构域构成的丝氨酸蛋白酶CLSP2在调节埃及伊蚊黑化反应和抗真菌免疫中的作用。首先利用免疫印迹和RNA干扰技术研究CLSP2在蚊虫受真菌刺激后血淋巴中的剪切作用及其对黑化反应的影响，从而明确其参与调节黑化反应的途径；其次，利用高通量转录组测序技术探讨CLSP2与蚊虫免疫通路Toll途径和IMD途径的相互作用，阐明CLSP2调节蚊虫抗真菌免疫反应的分子机制。主要研究成果包括我们表达并纯化了CLSP2的C端结构域rLectin，并制备了CLSP2的多克隆抗体和单克隆抗体，检测了rLectin对真菌的凝集结合作用。此外，通过高通量转录组测序技术，鉴定出受CLSP2调控的免疫基因群；分析了CLSP2在蚊虫抵御球孢白僵菌过程中对蚊虫天然免疫系统的调节作用，我们发现CLSP2对蚊虫主要免疫通路Toll和黑化途径起负调控作用，同时，CLSP2主要抑制了Toll通路胞外上游基因的表达，对胞内基因的调节作用微弱；CLSP2除了抑制黑化反应关键酶PPO3基因的表达，还抑制了PPO3的剪切，在感染球孢白僵菌后，这种抑制作用更加明显；我们还进一步发现PPO3的剪切激活参与蚊虫抗真菌免疫。通过本课题的研究明确该酶参与调节蚊虫黑化反应和抗真菌免疫的机制从而找到改进真菌杀虫剂效力的方法，为设计控制媒介昆虫的新思路提供理论参考。