RIPK1对软骨细胞凋亡的作用及机制研究

Chondrocyte apoptosis is an important part of joint degeneration. The receptor interacting protein kinase ( RIPK1) can regulate cell survival or apoptosis. Therefore, we infer that RIPK1 may be one of the factors that regulate the apoptosis of cartilage cells. By constructing a model of cartilage cell apoptosis ,the lentiviral RIPK1 vector should be constructed and RIPK1 should be induced in over expression of chondrocyte apoptosis model; By MTT, AO / EB staining ,hoechst33342 staining and live/Dead staining should be performed to observe the apoptosis of cartilage cells. DAPI staining should respectively be used the detection of chondrocyte apoptosis. RT-PCR and Western blot methods should be used to detect the cartilage cell gene and protein expression.We should analyzed the expression of anti apoptosis gene and protein, for example, Kbpl and Bcl-2, as well as the expression of Pro apoptotic genes and protein,for example, Bip, Atf4, Chop, Bax,, Caspase-9, Caspase-3, and Xbpls. It is concluded that RIPK1 regulates the corresponding mechanism of chondrocyte apoptosis so as to provide evidence for the prevention of joint degeneration by targeted therapy.

软骨细胞凋亡是导致关节退变的重要环节；受体相互作用蛋白激酶（recoptor-interaction protein kinase 1,RIPK1）可以双向调节细胞生存或凋亡。故我们提出：RIPK1可能是调控软骨细胞凋亡的因素之一。通过构建软骨细胞凋亡的模型，同时构建慢病毒RIPK1载体并诱导RIPK1在凋亡软骨细胞模型的过表达；进行MTT检测、AO/EB染色、Hoechest33342染色和live/Dead染色进行软骨细胞凋亡观察，分别应用DAPI染色检测软骨细胞的凋亡，应用RT-PCR和Western blot方法分别检测软骨细胞基因及蛋白表达。分析抗调亡基因及蛋白Bcl-2、Kbpl和Xbpls表达，以及促凋亡基因及蛋白Bip、Atf4、Chop、Bax、Caspase-9和Caspase-3表达。得出RIPK1调节软骨细胞凋亡的相应机制，从而为防止关节退变的靶向治疗提供依据。

骨关节炎是严重的老年性疾病，病因不清楚，治疗效果欠佳。近期研究认为与软骨细胞凋亡有关。该项目，研究硝普钠(SNP)和衣霉素（TM）诱导猪软骨细胞凋亡的作用浓度以及作用时间，为开发和评价预防软骨细胞凋亡的药物提供数据支持；探讨硝普钠诱导猪软骨细胞凋亡的潜在分子机制。本项目主要研究， 取成年猪踝关节软骨，在无菌环境下分离猪软骨细胞，体外培养并鉴定猪踝关节软骨细胞。培养猪软骨细胞，分别用0 mmol/L, 0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L, 0.8 mmol/L, 1.6 mmol/L硝普纳处理软骨细胞。分别在硝普钠和衣霉素（TM）处理软骨细胞12 h, 24 h, 48 h后检测软骨细胞的增殖情况。根据软骨细胞增殖检测结果对特定的硝普纳处理的软骨细胞进行凋亡检测和线粒体膜电位检测。最后对0 mmol/L, 0.8 mmol/L硝普钠处理的软骨细胞进行western blot和qPCR检测。该研究发现了，0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L SNP处理的软骨细胞的光密度( OD)值均大于0 mmol/L SNP处理的。其他SNP处理的软骨细胞的OD值均小于0 mmol/L SNP处理的。且其 SNP处理的软骨细胞的OD值之间相互比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。凋亡检测显示0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L, 0.8 mmol/L, 1.6 mmol/L SNP处理的软骨细胞发生了凋亡,且软骨细胞的凋亡率随SNP浓度的增大而加大。线粒体膜电位染色显示0 mmol/LSNP处理的软骨细胞的红光明显高于绿光。且随着SNP浓度的增大，软骨细胞的红色荧光强度与绿色荧光强度的相对比值逐渐缩小。western blot检测显示0.8 mmol/L硝普钠处理的软骨细胞的caspase9、RIPK1的蛋白表达量高于0 mmol/L SNP处理的。qPCR分析显示0.8 mmol/L硝普钠处理的软骨细胞的caspas-9的mRNA表达量高于0 mmol/L SNP处理的。0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L SNP均引发了软骨细胞的增殖，不能用于药物的开发和评价。其他浓度SNP均引发了软骨细胞的凋亡，可用于药物的开发和评价。此外，RIPK1在此过程中或许扮演了重要的角色。