Piccolo蛋白C2A结构域与Syntaxin 1A及脂筏磷脂相互作用在突轴囊泡胞吐调节中的作用

Piccolo是一种分布于神经突触活性区的大分子蛋白，其C2A结构域能够与Ca2+/磷脂的特异性结合。我们首次证明Piccolo是多巴胺神经元突触前负调节蛋白，参与神经突触可塑性调节（Mol Psychiatry,2008）。Syntaxin 1A是一种重要的囊泡蛋白，对囊泡导向及融合起重要作用。膜脂筏磷脂在神经递质囊泡的膜泊靠、融合等过程中非常关键。在前期成果基础上，本课题拟采用C2A结构域表达PC12细胞为试验体系，应用基因转染、囊泡荧光标记、全细胞膜片钳技术与膜电容测定等技术，系统研究Piccolo-C2A如何通过与Syntaxin 1A及膜脂筏磷脂的相互作用，调节囊泡胞吐过程。本课题不仅对阐明Piccolo-C2A在神经突轴囊泡调节中的新功能、新机制具有重要意义，而且对于更深刻全貌地认识囊泡转运调控、神经递质释放、Piccolo关联神经精神疾病病因等都具有重要的生物学意义。

Piccolo是一种特异性分布于神经突触活性区支架蛋白。本课题拟研究Piccolo-C2A是否通过与膜脂筏磷脂及膜Syntaxin 1A蛋白相互作用的机制实现该调节功能。. 研究结果表明：. （一）免疫荧光研究表明，在PC12细胞或原代中脑多巴胺能神经元中，Piccolo多呈斑点状分布于细胞膜上，分布特征与膜脂筏分布特征一致；转染Piccolo-C2A的PC12细胞，Piccolo-C2A亦呈斑点状分布于胞膜，与膜脂筏分布特征也一致。采用不连续蔗糖密度梯度法提取质膜脂筏分析膜蛋白组份，表明Piccolo-C2A 与Piccolo在质膜中均明显表达。上述表明，Piccolo及Piccolo-C2A与膜脂筏有紧密空间关联性。. （二）采用囊泡荧光标记（FM1-34）技术研究发现，Piccolo在KCl膜去极化刺激对囊泡转运、多巴胺释放无较大影响。细胞受到MAP刺激可致加速转运，但Piccolo-C2A可稳定囊泡转运、抑制多巴胺释放；采用反义Piccolo寡核苷酸抑制Piccolo表达，MAP诱导多巴胺囊泡释放增加。表明C2A结构域是参与囊泡转运、多巴胺释放的重要功能域。. （三）在生理条件下或MAP刺激条件下，Syntaxin 1A特异性裂解剂Bont/C、Bont/B对PC12细胞囊泡转运与多巴胺释放均无明显影响，表明Piccolo不通过前突轴蛋白Syntaxin 1A介导调节神经递质多巴胺释放。. （四）采用新霉素干扰膜脂筏磷脂，对PC12细胞囊泡转运与多巴胺释放无明显影响；但当PC12细胞受到MAP处理时，C2A明显抑制多巴胺的释放。结果表明，Piccolo可能通过C2A与突轴膜脂筏磷脂的相互作用，调节神经递质多巴胺的释放。. （五）Piccolo-C2A可参与PC12细胞膜流动性调节，这种参与效应在细胞受到应激刺激时，膜稳定性作用表现较明显。. 上述结果表明：Piccolo在神经前轴突不仅仅起支架作用，而且参与调节突轴囊泡转运。Piccolo-C2A通过与膜脂筏磷脂相互作用调节囊泡胞吐与神经递质多巴胺的释放，参与调节膜流动性。膜Syntaxin 1A蛋白并不介导该过程。