基于维生素B12核糖体开关的c-内酯钴胺素抑菌机理研究

Abuse of food preservatives and antibiotics has led to an increase of bacterial resistance. More and more attention on food spoilage caused by resistance bacteria has been paid. As a result, a novel target and microbial inhibitors is under urgent. It was reported that riboswitch binding substance analogues have a good antibacterial effect. Recent studies showed that vitamin B12 analogues in fermented soybean waste have some antibacterial effect. But action mode of inhibitory mechanism is unknown. This project is recognized c- lactone cobalamin as an object. On the basis of previous research results, action mode of c- lactone cobalamin based on riboswitch and other core issues will be studied, combined with microbiology, chromatography and molecular biology research methods. A c-lactone cobalamin inhibitory effect will be investigated. The relationship between B12 riboswitch and c-lactone cobalamin will be illuminated. The effect of c-lactone cobalamin on toxin and biofilm will be evaluated. Effects of c-lactone-cobalamin on riboswitch and gene expression profiling will be analyzed through suppression subtractive hybridization. The results from this project can not only be used as a guide for other mechanisms of antibacterial action of riboswitch analogue, but also a guide for the reuse of agriculture waste product.

由于食品防腐剂和抗生素滥用，导致了细菌的耐药性提高，而耐药性细菌引起的食物中毒事件已经引起了人们的广泛关注。因此，亟需寻找一种全新靶点的、安全的微生物抑制剂。国内外研究表明, 核糖体开关结合物质的类似物具有很好的抑菌作用。近年来研究发现，发酵豆制品废弃物中的维生素B12类似物具有一定的抑菌作用，但抑菌机理不明。本项目以c-内酯钴胺素为对象，在已有研究成果的基础上，围绕c-内酯钴胺素对于核糖体开关作用机理等核心问题，结合微生物学、色谱学和分子生物学等研究方法，建立起c-内酯钴胺素抑菌效应规律，探讨其基于维生素B12核糖体开关的抑菌关系，评价其对于细胞毒素和细胞被膜变化的影响，通过抑制差减杂交方法研究c-内酯钴胺素对于细菌相关基因表达谱的变化，从而阐明c-内酯钴胺素对细菌抑制作用机理。本研究不仅为c-内酯钴胺素作为食品新型防腐剂的开发提供重要的理论支持，同时也为农产品加工废弃物的利用奠定基础。

由于食品防腐剂和抗生素滥用，导致了细菌的耐药性提高，而耐药性细菌引起的食物中毒事件已经引起了人们的广泛关注。因此，亟需寻找一种全新靶点的、安全的微生物抑制剂。本研究成功地用化学修饰的方法得到维生素B12类似物，在实验中发现C-10-溴甲钴胺（MeCbl-C-10-Br）对单增李斯特菌有明显的抑制作用。依次通过对维生素B12依赖型酶和核糖体开关的研究，对MeCbl-C-10-Br的抑菌机理进行探讨。.通过氰/甲钴胺与卤化剂在不同反应条件下反应，筛选最有条件得到结构类似的维生素B12类似物CN-γ-内酯钴胺素和MeCbl-C-10-Br，比较CN-γ-内酯钴胺素、MeCbl-C-10-Br、氰钴胺、甲钴胺分别对大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、婴儿双歧杆菌和罗伊氏乳杆菌的生长调节作用。改变MeCbl-C-10-Br浓度检测对有害菌金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的最小抑菌浓度，结果显示MIC分别是1 ng/mL和0.125 ng/mL。通过应用腺钴胺依赖型酶甘油脱水酶和甲钴胺依赖型酶甲硫氨酸合成酶的粗酶液体系，探究维生素B12及其类似物对维生素B12依赖型酶的酶活影响。结果表明与甲钴胺相比，MeCbl-C-10-Br对甘油脱水酶和甲硫氨酸合成酶具有较高的催化活性，与MeCbl-C-10-Br抑制单增李斯特菌生长相悖。本研究评价了不同浓度的氰钴胺、甲钴胺、CN-γ-内酯钴胺素和MeCbl-C-10-Br分别对单增李斯特菌维生素B12核糖体开关调控作用。结果表示MeCbl-C-10-Br对维生素B12转运蛋白、合成蛋白和功能蛋白相关的核糖体开关均有明显的抑制作用，甲钴胺对合成相关的维生素B12核糖体开关有促进作用，对转运和功能相关的核糖体开关则表现出抑制作用，强度弱于MeCbl-C-10-Br，说明维生素B12类似物MeCbl-C-10-Br对单增李斯特菌的抑菌位点在维生素B12核糖体开关。由此可见，维生素B12类似物MeCbl-C-10-Br对单增李斯特菌有明显的抑制作用，其抑菌机理不是通过调节维生素B12依赖型酶甘油脱水酶和甲硫氨酸合成酶的酶活，而是通过抑制维生素B12核糖体开关，从而抑制相关蛋白的表达，进一步影响单增李斯特菌的正常生长。本研究不仅为c-内酯钴胺素作为食品新型防腐剂的开发提供重要的理论支持，同时也为农产品加工废弃物的利用奠定基础。