P2Y受体在激光针灸镇痛效应外周机制中的作用

以完全佛氏佐剂关节炎大鼠为模型，探索低能量激光（657nm，55mW）针灸的镇痛疗效与穴区（足三里）嘌呤类物质释放量的关系。并进一步利用胞内钙荧光成像和膜片钳全细胞记录技术，在单细胞水平上研究该激光照射对原代培养大鼠背跟神经节（DRG）细胞、原代培养大鼠腹腔肥大细胞（RPMSc）及两类细胞之间P2Y受体（P2Y1、P2Y2、P2Y4和P2Y6）信号通路的影响。在细胞和分子水平上探索激光针灸对穴区局部P2Y受体介导的信号系统的影响，为深入了解激光针灸镇痛效应的外周机制提供最有力的实验依据。

激光针灸是低剂量激光疗法与传统中医的针灸术相结合的一种新型疗法，具有缓解多种疼痛的功效。嘌呤能信号系统是机体重要的疼痛机制之一。ATP及其水解产物是该信号系统中重要的内源性激动剂。近10 年来，国内外中医药研究人员以神经-内分泌-免疫网络学说为切入点，对针灸调整机制进行了进一步地研究，使原有的针灸机制理论得到了补充和深入。最近几年，肥大细胞这种主要的免疫细胞被发现参与穴位的结构和功能特异性：该细胞在穴区富集，参与手针河艾灸的镇痛疗效。神经系统无疑在针刺效应主要机制之一。神经元和肥大细胞之间不仅在空间分布存在相关性，而且在功能上存在生物信息的相互交流。那么在激光针灸过程中，是否存在激光照射调节穴区肥大细胞和DRG神经元ATP释放及相关受体活性。这既是本项目研究的核心内容。.本项目主要利用膜片钳、钙荧光成像及生物萤光发光技术等研究低剂量红色激光照射对肥大细胞和DRG感觉神经元全细胞电流、胞内钙离子活动以及胞外ATP代谢的影响，及内在机制分析。.结果显示：（1）657 nm，280 mW/cm2低剂量（17、51、85 J/cm2）激光照射可导致HMC-1细胞（人培养肥大细胞系）胞外ATP含量增加。进一步对胞内ATP含量及胞内游离钙离子浓度（[Ca2+]i）进行测量，提示激光照射导致胞外ATP含量上升归因于胞内ATP合成的提高和ATP释放的增加。这种激光激活肥大细胞的效应同样出现在野生型大鼠肥大细胞上：激光照射可导致大鼠腹腔肥大细胞胞外ATP含量的增加，和大鼠足三里皮下结缔组织内肥大细胞脱颗粒。（2）在大鼠背根神经节（DRG）细胞上， 657nm，17.6 mW/cm2，21 J/cm2照射可导致DRG神经元胞外ATP释放下降。进一步对细胞ATP水解酶的分析证明，激光照射通过上调ATPase活性，进而导致DRG神经元胞外ATP含量的降低。膜片钳全细胞电流记录显示：657nm，17.6 mW/cm2激光照射可导致培养DRG神经元Na+电流的降低。.科学意义：激光照射对肥大细胞和DRG神经元胞外ATP含量的截然相反的调节作用，考虑该两类细胞在结构和功能上的相关性，我们猜想：在激光针灸过程中，肥大细胞提供嘌呤水解产物的前体（ATP），而与之相邻的外周神经细胞（纤维）提供ATP水解酶，最终使得胞外具有镇痛效应的水解底物AMP或腺苷水平上升，从而发挥缓解疼痛的目的。