中国石蒜MYB转录因子调控加兰他敏生物合成作用机制解析

Galantamine is one of the first choice drugs in the treatment of senile dementia; the market price is expensive . At present medicinal galantamine is mainly extracted from plants. But the low content of galanthamine in Lycoris is a key restricting factor of increasing galanthamine production. Therefore, exploring galanthamine biosynthesis mechanism of Lycoris and creating new Lycoris varieties with improved galanthamine content by genetic engineering breeding methods have become the focus question at home and abroad. So far,over-expressing galantamine-synthetic-related genes can not evidently enhance galantamine content in transgenic plants. The latest research shows that MYB transcription factors play an important role in plant secondary metabolism. They can activate a few genes co-expression and effectively regulate the secondary metabolic pathways. In our research, we will isolate Lycoris MYB transcription factor family genes, which response jasmonic acid and inducer to improve galantamine content, then identify their downstream genes and interaction factors. Our goal is to understand the molecular regulatory mechanism of the MYB genes in galantamine synthesis and jasmonic acid signalling pathway from transcription and post transcription aspects, and then to excavate the genes for further transgenic breeding of new Lycoris cultivars with high galantamine content.

加兰他敏是治疗老年痴呆的首选药物之一，市场价格昂贵。目前药用加兰他敏主要从植物中提取。但加兰他敏在石蒜内含量低成为限制其产量的因素。探明石蒜加兰他敏生物合成机理，利用基因工程手段，进行高加兰他敏含量的新品种定向培育成为国内外共同关注的问题。迄今为止，对加兰他敏合成相关基因的研究，在提高石蒜体内加兰他敏的含量上作用不显著。最新的研究表明，MYB转录因子在植物次生代谢中起着重要作用，通过与结构基因结合，MYB转录因子可激活次生代谢合成途径中多个基因协同表达，从而调控次生代谢途径。本研究拟从石蒜中筛选响应茉莉酸等诱导物诱导提高加兰他敏含量的MYB转录因子家族成员，鉴定其下游基因和互作因子，从转录和转录后多个层面，探讨MYB转录因子在石蒜加兰他敏生物合成及茉莉酸信号转导途径中转录调控机理，进而为培育高加兰他敏含量的石蒜新品种提供有效的基因储备。

本研究以探讨中国石蒜MYB基因的功能为目的，克隆了5个LcMYB基因全长，通过半定量表达，筛选出在茉莉酸甲酯处理下变化显著的LcMYB1基因，并对该基因的表达特性和生化特性进行分析。LcMYB1基因全长1136bp,推测该蛋白具有2个 MYB结构域，在C-端存在一个酸性活化区域，判断为R2R3MYB转录因子。经过RT-PCR分析，LcMYB1基因的表达主要集中在花和花葶中。.分离得到LcMYB1基因上游1311bp DNA序列，经分析，在LcMYB1启动子区域中包含了一些重要的响应光、生物胁迫及非生物胁迫、植物生理反应、及激素的顺式作用元件。通过烟草表皮瞬时表达系统和酵母转录激活系统对LcMYB1蛋白的亚细胞定位和转录活性进行了研究。结果表明，LcMYB1蛋白定位在细胞核内，并具有较强的转录激活活性，且其转录激活活性主要源自蛋白C端的转录激活能力，而不是N端的R2 、R3结构域。.成功获得LcMYB1过量表达的拟南芥和中国石蒜植株以及RNAi中国石蒜植株。与对照相比，LcMYB1过量表达植株有着较强的耐茉莉酸、干旱、盐渍胁迫耐性。通过高效液相色谱法测量生物碱含量，过表达和RNAi LcMYB1基因的中国石蒜体内，加兰他敏等生物碱的含量变化不显著。关于LcMYB1基因在加兰他敏等生物碱合成的作用还需要进一步研究。.通过RNA-seq，在甲基茉莉酸处理时，中国石蒜中共有1094条unigene表达量发生明显改变，其中上调基因数量为565条；下调基因数量为529条。与对照相比，不同转录家族基因表达的数量也有很大不同，NAC、BHLH、MYB等转录因子家族的基因数量都有明显变化。.比较中国石蒜叶片与花中的表达差异基因，主要为代谢相关。本研究中的LcMYB1基因也是在花期特异表达的MYB家族基因，推测中国石蒜中的LcMYB1不仅与茉莉酸信号传导有关，还与成花诱导有关。值得注意的是茉莉酸诱导能同时促进多酚氧化酶（PPO）基因家族的上调表达，因此推测多酚氧化酶在茉莉酸信号传导和加兰他敏等生物合成中具有重要作用。LcMYB基因、PPO基因家族在茉莉酸信号调控网络中具体的调控方式需要进一步研究。