Blind-Sterile小鼠雄性不育致病基因的定位克隆及功能研究

Blind sterile (bs) is a spontaneous autosomal recessive mouse mutation exhibiting abnormal spermatogenesis, abnormal head shaping of spermatids, male infertility and cataracts. The head abnormalities of spermatids is similar to those described in human globozoospermia. But the location of the causative gene in bs mice and the molecular events leading to male infertility are still poorly understood. Our previous study showed that Bpifb5 is a causative gene in bs mice by linkage and selected genome sequence analysis. BPIFB5 is a member of the BPI family, but the function of BPIFB5 in spermatogenesis is not clear. In the present study, we plan to study the expression characteristics of BPIFB5 in spermatogenesis by qRT-PCR, Western blot, immunofluorescence and immunoelectron microscopy. In order to reveal the biological function of Bpifb5 in spermatogenesis, lipid binding assay, lipid transfer activity assay and live-cell real-time imaging will be carried out. This study will shed light on the mechanism of Bpifb5 in spermatogenesis and provide a theoretical basis for the pathogenesis, genetic diagnosis and clinical treatment of globozoospermia.

Blind-Sterile (bs)小鼠是一种自发突变小鼠，属常染色体隐性遗传，表现为精子发生障碍、顶体发育异常和雄性不育，并伴有白内障，其顶体异常的表型与人圆头精子症表型相似，但其致病基因及作用机制尚不明确。本项目前期采用定位候选克隆和基因组靶向捕获测序技术，确定Bpifb5为bs小鼠的致病基因。BPIFB5属转脂蛋白BPI家族，但在生精过程中其作用尚未见报道。本项目拟采用qRT-PCR, Western blot,免疫荧光和免疫电镜等方法，确定BPIFB5在小鼠精子形成过程中的表达和定位特征；通过脂结合和脂运转实验，检测BPIFB5的脂结合能力和脂运转活力；通过活细胞实时观测技术，检测BPIFB5在生精细胞中的脂转运途径，确认其在生精过程中的生物学功能。本项目的实施将初步阐明BPIFB5在小鼠精子发生中的作用机制，为研究圆头精子症的发生机理、基因诊断和临床治疗提供理论依据。

背景：Blind-Sterile (bs)小鼠是一种自发突变小鼠，属常染色体隐性遗传，表现为精子发生障碍、顶体发育异常和雄性不育，并伴有白内障，其顶体异常的表型与人圆头精子症表型相似，但其致病基因尚不明确。本项目采用定位候选克隆和基因组靶向捕获测序技术，确定Bpifb5为bs小鼠的致病基因。但Liegel et al. (2013)的研究显示BS小鼠的白内障表型源于胚胎期起始的晶状体纤维细胞成熟异常和高度凋亡状态，并发现Tbc1d20内的一个c.691T>A突变可能是BS小鼠遗传缺陷的候选基因。到2014年，Park et al.(2014)利用锌指酶构建了Tbc1d20突变模型并重演了BS小鼠的白内障和睾丸生精缺陷表型，从而进一步证实了Tbc1d20突变是BS小鼠表型异常的遗传原因。但是TBC1D20具体通过怎样的细胞生物学和分子机制导致BS小鼠的白内障和无精症缺陷，目前尚不明确。因此，本项目后续的由研究Bpifb5调整为研究Tbc1d20在生精过程中的生物学功能。..主要研究内容: 1. bs小鼠睾丸形态学分析及 bs小鼠睾丸中各级生殖细胞的发育情况。2. 观察TBC1D20蛋白在睾丸组织中以及在293t细胞中的定位特征。3. Tbc1d20在生精过程中的生物学功能的作用机制。..重要结果：1.bs小鼠成熟睾丸的生精小管形态趋于不规则，管腔更小，生精小管内各级生精细胞减少甚至缺失，排列紊乱，呈现空腔现象。2.免疫荧光共定位显示Tbc1d20在成熟野生型小鼠睾丸主要表达在生殖细胞和支持细胞的高尔基体。将Tbc1d20-EGFP过表达在293t细胞系中，激光共聚焦扫描显示活细胞状态下Tbc1d20-EGFP主要定位在内质网和高尔基体上。但是，在WT小鼠睾丸中，并没有观察到内源性Tbc1d20在内质网上的明显聚集。3.在bs null小鼠的睾丸细胞中，高尔基体和内质网的相应标记蛋白，GM130和ERp72也在相应亚细胞结构上缺失。..关键数据及其科学意义：Tbc1d20的突变可能导致了睾丸细胞中相应细胞的高尔基体和内质网的结构异常，或者通过与其互作蛋白影响了重要功能蛋白在高尔基体和内质网上的锚定和聚集，甚至组装和运输。本项目的实施初步阐明了Tbc1d20在小鼠精子发生中的作用机制，为研究源头精子症的发生机理、基因诊断和临床治疗提供理论依据。