基于ERα/CLCF1/JAK2/STAT3通路探讨PMOP肾阴虚证的分子机制

JAK2/STAT3 signaling pathway plays a key role in the process of maturation of osteoclasts. Estrogen can active the signaling pathway.But Whether estrogen influenced bone metabolism through this pathway is unclear. Previous study found the important gene CLCF1 of PMOP with kidney yindeficiency influenced bone metabolism by regulation of JAK2/STAT3 signaling pathway. There is ER binding elements on CLCF1 promoter by bioinformatics prediction. We speculate the molecular mechanism of PMOP withkidney yin deficiency is related to estrogen mediating new signaling pathway--ERα/CLCF1/JAK2/STAT3 and influencing bone metabolism. First of all,we study the effects of estrogen on expression of CLCF1、JAK2 /STAT3 signaling pathway in vivo and in vitro by MTT, flow cell, Elisa, qPCR and WB technology .Secondly,we explore the molecular mechanism of Er binding to CLCF1 promoter element to promote CLCF1 transcription through the luciferase reporter gene and chromatin immunoprecipitation assay .At last,we detectect of the level of estrogen and CLCF1、JAK2 、STAT3 after liuwei dihuang pill treatment of PMOP with kidney Yin deficiency patients.The study is to elucidate the new way of estrogen regulating bone metabolism and the molecular mechanism of PMOP withkidney yin deficiency.

JAK2/STAT3信号通路是破骨细胞成熟的关键通路，雌激素可激活此通路，但雌激素是否通过该通路影响骨代谢尚不清楚；课题组研究发现绝经后骨质疏松症（PMOP）肾阴虚证关联基因CLCF1能调控JAK2/STAT3通路影响骨代谢；生物信息学预测CLCF1启动子有雌激素受体（ER）α结合元件。故提出假说：PMOP肾阴虚证的分子机制可能与雌激素介导新的信号通路--ERα/CLCF1/JAK2/STAT3调控骨代谢密切相关。课题拟：①用MTT、流式细胞、Elisa、qPCR及WB等技术体内、外实验检测雌激素对CLCF1、JAK2/STAT3通路的影响；②通过荧光素酶报告基因及染色质免疫沉淀实验，探讨ERα调控CLCF1转录的分子机制；③通过观察六味地黄丸治疗PMOP肾阴虚证的雌激素与CLCF1、JAK2、STAT3表达水平，验证科学假说。旨在阐明雌激素调控骨代谢的新途径和PMOP肾阴虚证的分子机制。

绝经后骨质疏松症（PMOP）是一种与衰老有关的常见病，主要发生在绝经后妇女，是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，导致骨脆性增加，易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。PMOP严重地影响了老年人的身体健康。雌激素在维持骨代谢动态平衡方面扮演着非常重要的角色，其机制极为复杂且未被完全阐明。本研究提出：PMOP肾阴虚证的分子机制可能与雌激素介导新的信号通路--ERα/CLCF1/JAK2/STAT3调控骨代谢密切相关。课题通过临床、动物、细胞、机制实验表明：①17β-雌二醇刺激MG-63细胞可以促进CLCF1、JAK2、STAT3基因、蛋白的表达，促进细胞的增殖，细胞周期的进展,提高碱性磷酸酶ALP的活性。②跟假手术组相比，模型组大鼠胫骨、股骨骨密度降低；骨组织比例、骨小梁数量、骨小梁厚度降低，骨小梁分离度升高；最大载荷、最大应力和断裂点载荷降低；雌激素、PINP表达水平降低，S-CTX表达水平升高；CLCF1蛋白水平显著降低。雌二醇可提高骨密度、骨组织比例、骨小梁数量和骨小梁厚度，减小骨小梁分离度；提高最大载荷、最大应力；提高雌激素水平、PINP水平，降低S-CTX表达水平。③PMOP肾阴虚组CLCF1、JAK2 mRNA表达水平低于对照组，PMOP肾阴虚组CLCF1蛋白表达水平低于对照组。六味地黄丸治疗PMOP肾阴虚证六个月后，CLCF1、JAK2 mRNA表达水平显著提高，骨形成指标PINP表达显著提高。④机制实验表明：雌激素受体Era不能增强MG63细胞中CLCF1基因的启动子活性，但是17β-雌二醇能显著提高CLCF1基因的启动子活性，促进基因的转录。通过DNA pull down联合质谱鉴定，以及平行反应监视实验筛选出可能与CLCF1基因结合的5个转录因子：MAFK、FOSL2、JUNB、MITF、TFE3。荧光素酶报告基因和chip-PCR实验证明TFE3、MITF、JUNB这3个转录因子对CLCF1基因具有靶向调控作用，TFE3、MITF、JUNB是CLCF1的转录抑制因子。且细胞实验证明雌激素会抑制TFE3基因、蛋白的表达。结论：雌激素可通过抑制TFE3表达，促进CLCF1基因表达上调，进而激活JAK2/STAT3信号通路。这个新的作用途径对于阐明雌激素调控骨代谢的分子机制是一个补充，对于阐明PMOP肾阴虚证的分子机制以及PMOP的临床防治都具有重要意义。