Atp8a2基因在视网膜病变发病机制中的功能研究

Glaucoma is a retinal neurodegenerative disease affecting 70 million people worldwide and is one of the leading causes of blindness. In glaucoma and other retinal diseases, optic nerve injury leads to retinal ganglion cell (RGC) death. Different degeneration processes occur in different compartments of the RGC during glaucoma. RGC axonal degeneration in the optic nerve head (where RGC axons exit the eye) is an important early event in glaucomatous neurodegeneration. However, the molecular mechanisms underlying axon damage in glaucoma is not well defined. In previous work, the applicant has already established a novel axonal degeneration animal model and for the first time demonstrated the role of a phosphatidylserine (PS) flippase Atp8a2 in neurodegenerative disease. This work demonstrated the role of membrane PS distribution in the maintenance of proper structure and health of an axon. In order to understand the role of membrane PS distribution in RGC degeneration, we propose to investigate PS asymmetry and protein trafficking in RGC to reveal the relation of Atp8a2 function, PS asymmetry and neuron function. This proposed research will provide valuable information for RGC axon degeneration and be helpful to study of disease mechanisms and therapy development in glaucoma.

青光眼是一种视网膜疾病，在全世界范围影响七千万人，是导致失明的最常见原因之一。在青光眼和其他视网膜疾病中，视神经损伤导致视网膜视神经节细胞死亡。青光眼发病过程中视网膜视神经节细胞轴突和胞体存在着不同的变性过程。轴突变性是青光眼退行性病变中关键病理过程。但视神经节细胞轴突损伤的分子机制还不清楚。在前期工作中，本申请人已建立了一个新的神经轴突病变动物模型，开创性地证明了磷酸酰丝氨酸（PS）内翻酶Atp8a2在退行性神经病变中的作用。该研究工作首次揭示了磷酸脂类分子膜上分布在维持神经轴突正常形态和健康中的作用。为进一步了解膜上 PS 分布在视网膜视神经节细胞病变过程中的作用，我们拟采用分子细胞和遗传学方法，研究视神经节细胞中PS不对称分布和蛋白运输，以揭示Atp8a2，PS膜上分布和神经元功能之间的关系。此项研究将为视网膜视神经节细胞的轴突病变过程提供有价值信息，有助于青光眼疾病机理和治疗研究。

视神经损伤是青光眼病变过程中的关键步骤。本课题组前期建立了磷酸酰丝氨酸(PS)内翻酶（Phosphatidylserine flippase) Atp8a2突变的神经轴突病变模型，揭示了PS膜分布对神经元正常功能的作用。本研究着重研究Atp8a2在视网膜中的功能，并探索了PS flippase beta 亚基Tmem30a 在视网膜中功能。研究发现了Atp8a2突变细胞膜上PS分布情况，初步明确了Atp8a2 突变视网膜蛋白运输的分子机制；证明了Caspase 6 在Atp8a2 轴突病变中无保护作用。Atp8a2蛋白定位于视网膜感光细胞外节和视神经节细胞。Atp8a2突变细胞膜在一个月的时候即出现外节Outer segment，OS）变短，外核层细胞数目减少；暗光ERG a、b波峰值均降低。但重要视网膜外节组成蛋白如Rhodopsin，Peripherin，CNGalpha可以正常运输定位到OS。Atp8a2运输需要结合其beta 亚基Tmem30a。为研究PS flippase beta 亚基Tmem30a的体内功能，我们构建了Tmem30a条件性基因敲除小鼠模型，发现视锥细胞特异敲除视网膜视锥Opsin 表达定位有缺陷，光反应重要膜蛋白CNG3表达降低，视网膜光反应峰值大幅降低，视锥细胞出现死亡。视杆细胞敲除视网膜表现出视紫红质表达降低，外节变短，外核层细胞数目减少。这些数据表明Tmem30a在视网膜感光细胞中有重要功能。我们还构建了小脑蒲金耶氏细胞（Purkinje Cell）特异敲除小鼠目眩，发现 Tmem30a小脑特异敲除小鼠表现出共济失调、蒲金耶氏细胞内质网压迫反应（ER stress）标志PDI表达增高，TUNEL染色揭示细胞凋亡，拓展了Tmem30a在小脑蒲金耶氏细胞（Purkinje cell）中的功能。我们的数据揭示了Tmem30a在视网膜和小脑中有重要作用。