利用转基因小鼠模型研究CUL4B基因在肝细胞癌发生发展中的作用及机制

肝细胞癌是一种致死率非常高的恶性肿瘤，建立小鼠肝细胞癌模型将为肝细胞癌的研究提供有力的工具，常用的方法包括化学诱导模型和转基因小鼠模型等。CUL4B基因属于CULLIN基因家族，该基因家族成员编码的蛋白质做为骨架蛋白参与构成E3泛素连接酶复合物，参与调控转录因子、细胞周期蛋白、癌蛋白、抑癌蛋白、组蛋白和膜蛋白等多种蛋白质的降解。根据文献报道和我们对CUL4B基因的前期研究结果，提示CUL4B基因有可能作为癌基因发挥作用。为此，本研究将在前期工作的基础上，建立CUL4B转基因小鼠模型，并分析过表达CUL4B基因对小鼠肝细胞增殖的影响；分析过表达CUL4B基因对DEN诱导的小鼠急性肝损伤和肝细胞癌发生发展的影响及其机制；分析过表达CUL4B基因对小鼠肝脏自发成瘤的影响及其机制。通过以上研究，初步阐明CUL4B基因在肝细胞癌发生发展过程中的作用及其分子机制。

CUL4B基因属于CULLIN基因家族，该基因家族成员编码的蛋白质做为骨架蛋白参与构成E3泛素连接酶复合物，参与调控多种蛋白质的降解和泛素化修饰。本项目围绕CUL4B基因在肝细胞癌发生发展中的作用及其分子机制，通过构建CUL4B转基因小鼠模型，从分子机制、细胞增殖、组织病理、小鼠成瘤表型等方面系统研究了CUL4B在肝细胞癌中的功能，取得了以下研究结果：. 第一，成功建立CUL4B转基因小鼠模型并鉴定转基因的表达：我们建立了CUL4B转基因小鼠，并从DNA、RNA、蛋白质和荧光等多个水平鉴定了转基因的表达情况，为在体内研究CUL4B基因在肝细胞癌发生发展中的作用提供了一个良好的模型。. 第二，过表达CUL4B促进小鼠肝细胞增殖：通过BrdU掺入实验证实CUL4B转基因小鼠的肝细胞增殖加快，在分子水平上检测到CUL4B转基因小鼠肝组织中Cyclin D1、Cdk1和Cdk4表达升高，而p16表达降低。. 第三，过表达CUL4B促进DEN诱导的小鼠急性肝损伤：通过对CUL4B转基因小鼠及对照小鼠注射DEN诱导急性肝损伤，我们发现CUL4B转基因小鼠血清中的肝损伤标记物ALT和AST水平明显升高，并且急性肝损伤后肝细胞的代偿性增殖加快。分子水平上，我们发现注射DEN诱导小鼠急性肝损伤后CUL4B转基因小鼠肝组织中p-p65、p-Akt（T308）、p-Erk及p-p38等促进细胞增殖的信号通路中的关键分子表达明显升高。此外，我们还发现CUL4B转基因小鼠肝组织Prdx3降解加速，导致肝组织中ROS水平升高。. 第四，过表达CUL4B促进DEN诱导的小鼠肝细胞癌发生发展：对小鼠注射DEN并用苯巴比妥联合作用，26和52周后分别检测小鼠肝细胞癌的发生情况，发现CUL4B转基因小鼠的肝脏肿瘤数量明显多于野生型对照小鼠，最大肿瘤直径、肝重/体重比及血清ALT、AST含量等指标均明显高于野生型对照小鼠。此外组织学分析还发现，CUL4B转基因小鼠的肝细胞增殖加快，β-catenin的表达升高，脂肪含量明显增加。. 第五，CUL4B转基因小鼠可以自发肝细胞癌：在24个月大时，80%的CUL4B转基因小鼠检测到肝细胞癌，而野生型对照小鼠的肝脏基本没有自发成瘤的情况，该结果提示CUL4B转基因小鼠的肝脏可以自发成瘤。