梨属植物DAM基因的分子进化及其调控梨芽内休眠的机理研究

In this study, the copy number, structure and location of dormancy associated MADs-box transcription factor (DAM genes) will be determined based on the genome of pear. The DAM genes will be isolated at both genomic and transcriptional levels (lateral vegetative and flower bud under endodormancy) from extensive pear accessions with distinct chilling requirement. The expression changes of DAM genes in different transitional phases of dormancy and their relationships with chilling requirement will be determined by Q-PCR. Based on comparative genomes of pear, peach and other plants as well as transcriptomic database associated with dormancy, the target genes and related miRNAs of pear DAMs will be predicted using bioinformatic tools, which will further validated by Q-PCR, to initially construct the interaction network of DAM-miRNA-gene during different pear dormancy phases. The final object of this study is to elucidate the regulation mechanism of DAM genes in pear endodormancy and their relationships with chilling requirement, which will provide bases for developing low chill-cultivars and exploiting related cultivation techniques.

本研究基于梨基因组数据分析梨内休眠相关MADs-box转录因子（DAM基因）的拷贝数量、位置和结构。选用需冷量各异的梨属代表样本，分别从基因组水平和转录水平（内休眠侧叶芽和侧花芽中）分离各DAM拷贝，通过系统发育分析阐明拷贝间进化关系。通过Q-PCR研究内休眠进程中侧叶芽和侧花芽中各DAM的表达模式及其与需冷量之间的相关性。通过比较梨和桃等基因组及梨内休眠相关转录组数据，应用生物信息学技术预测DAM的靶基因及内休眠相关miRNA，并通过Q-PCR进行功能验证，初步构建梨内休眠进程中DAM-gene-miRNA互作网络。本研究的最终目的是解明DAM调控梨内休眠的分子机理及其与需冷量间的关系，为低需冷量品种选育、遗传改良及相关的栽培管理技术开发提供依据。

梨是我国重要的落叶果树，芽内休眠能否顺利解除是影响其果实产量和品质的重要因素。其芽内休眠相关的一些相关的转录因子如DAM（Dormancy-associated MADS-box genes）已被鉴定，但这些转录因子和相关miRNA及靶基因是如何协同调控芽休眠的研究尚未见报道。本项目系统研究了DAM等基因在梨休眠诱导、维持和解除中的调控机理。从梨基因组中鉴定了30条MIKCC-type MADS Box基因，对其组织特异性表达和在内休眠过程中的表达模式进行了分析。结果表明，这些基因在芽休眠过程中的表达模式差异较大，可能在芽休眠过程中扮演着不同的角色。酵母单杂实验和双荧光素酶检测实验发现冷响应因子PpCBF可能通过结合PpDAM1和PpDAM3的C-repeat/DRE位点激活其表达来诱导芽休眠的进入；PpDAMs通过抑制PpFT2的表达来维持内休眠的状态。. 通过对microRNA生物信息学预测和小RNA测序，我们一共鉴定了185条保守的miRNA、24条非保守的miRNA和32条梨特异的miRNA。通过对miRNAs和MIKC基因的联合分析以及降解组的数据分析后发现，在芽休眠解除的过程中miR6390可能通过降解PpDAMs来解除PpDAMs对PpFT2的抑制效应从而解除休眠。综上所述，我们得出了一个以DAM基因为中心的梨芽休眠的分子调控模型：短时低温诱导CBF基因的表达，进而促进DAM基因的表达，从而诱导内休眠的进入；进入休眠后DAM蛋白抑制了FT2的表达，从而抑制了芽的萌动过程并维持这种休眠状态；7.2℃以下的低温积累过程中DAM基因表达显著性下调，从而解除了对FT2基因表达的抑制，促进芽内休眠的解除和芽的萌动，而DAM基因表达的显著性下调可能是miR6390特异性降解引起的。. 本研究结果基本明确了DAM基因-miRNA靶基因调控梨芽内休眠进入、维持和解除的分子机制，为遗传育种和破休眠及花期控制等栽培技术的研究提供了重要的理论依据。