日本血吸虫氧化还原平衡及其抑制剂的研究

虽然吡喹酮是当前治疗血吸虫病的有效药物，但大规模使用吡喹酮进行治疗易产生耐药性, 因此，研制新的血吸虫病治疗药物是当务之急。血吸虫在宿主体内生存受到宿主免疫系统及自身代谢活动产生的活性氧化物的损伤，它必须通过一些关键的氧化还原酶的催化作用来还原被活性氧氧化的二硫键及巯基，解除活性氧的毒性作用，维持自身氧化还原的平衡。发展特异性抗血吸虫氧化还原酶的抑制剂，抑制这些氧化还原酶的解毒功能，破坏血吸虫体内的氧化还原平衡将可达到杀灭血吸虫的目的。本研究拟以血吸虫的氧化还原生化过程为目标，克隆和表达日本血吸虫独特的氧化还原酶-硫氧还蛋白谷胱甘肽氧化还原酶（TGR）基因，分析其蛋白结构，设计并合成潜在的可抑制该蛋白酶功能的抑制剂。经体外酶活性抑制试验筛选有效的化学抑制剂，通过动物试验进一步研究这些抑制剂治疗血吸病的效果及其毒副作用，寻找对宿主毒副作用小而对血吸虫杀灭效果好的日本血吸虫病治疗新药。

目前，治疗血吸虫病唯一有效药物为“吡喹酮”，由于长期被大规模普遍使用，已出现对吡喹酮耐药现象，发展新的血吸虫病化疗药物已成为十分急迫的问题。从不同的途径阻断血吸虫氧化还原平衡代谢过程均能杀灭曼氏血吸虫，表明血吸虫氧化还原平衡代谢过程是血吸虫病治疗新药研究的潜在靶标。. 本项目首次克隆编码日本血吸虫中国大陆株硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）基因，设计和构建了能在大肠杆菌中表达SjTGR硒蛋白的嵌合基因,及其重组表达质粒SjTGRsec/pET41a。将重组质粒SjTGRsec/pET41a和pSU ABC共转化大肠杆菌BL21(DE3)，在低温下诱导表达出可溶性SjTGR硒蛋白。酶学分析表明重组SjTGR硒蛋白具有具有谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶及谷胱还蛋白还原酶三种酶活性。免疫印渍显示血吸虫成虫蛋白中只有一条分子量与重组SjTGR（约65kDa）相似的蛋白条带可被抗重组SjTGR蛋白血清所识别，证示日本血吸虫体内没有单一的硫氧还蛋白还原酶及谷胱甘肽还原酶存在，它们的功能被单一的SjTGR所取代，证明了SjTGR是日本血吸虫氧化还原平衡的必须分子，是治疗新药开发的潜在靶标。. 证实临床上用于治疗类风湿性关节炎的药品—金诺芬等对SjTGR蛋白酶活性具有显著的抑制效果，在体内、外均具有杀灭血吸虫的效果，可作为血吸虫病治疗的另一辅助药物。4-苯基-1,2,5-恶二唑-3-甲腈-2-氧化物（噁二唑类）是另一个有效的SjTGR蛋白酶活性抑制剂。设计合成了30种新的噁二唑类化合物，其中16种化合物对重组SjTGR蛋白酶活性具有显著的抑制作用，27种化合物在体外具有明显的杀虫效果。这些全新的化合物将可作为治疗新药开发的前体药物。筛选到3条能与SjTGR蛋白特异结合，并能有效抑制重组SjTGR蛋白酶活性的多肽。采用等温滴定量热法（ITC）试验验证了肽JIPDys1与SjTGR的相互作用机制。设计合成了85种吡喹酮类似物，证示其中20种化合物与吡喹酮的杀虫效果相似。设计合成了由吡喹酮药效团与噁二唑药效团组成的多效化合物。. 本研究证明了SjTGR蛋白是日本血吸虫氧化还原平衡过程的瓶颈分子，是新药开发的重要靶标，设计、合成并筛选到一批能抑制SjTGR蛋白酶活性，具有治疗效果化学抑制剂，为发展新的血吸虫病治疗药物与多效靶向治疗方法奠定了坚实基础。