Calpain-I通过内质网应激-自噬反应在房颤发生机制中的作用及研究

It is testified that calcium homeostasis is one of the most important mechanisms in atrial fibrillation (AF) initiation and progression. Accumulated studies have shown that the pathway of endoplasmic reticulum stress (ERS) - autophagy could promote fibrosis of atrial myocytes, which play important roles in AF occurrence. Our previous research found that calpain-I could regulate calcium homeostasis and status of RyR2 within the sarcoplasmic reticulum (SR), which could trigger abnormal calcium release event (Ca2+ sparks and Ca2+) in AF. Additionally, further studies have verified the effect of calpain-I in the occurrence of autophagy via ERS in cardiomyocytes which suggested possible roles of calpain-I in abnormal calcium release events and calcium homeostasis through ERS-autophagy pathways..This study was designed to investigate whether calpain-I could promote occurrence of AF via ERS-autophagy pathways. We employed techniques of stimulated emission loss microscopy, single-particle freeze electron microscopy and planar lipid membrane single-channel in established telemetry rapid atrial pacing rabbit AF model and isolated rabbit atrial myocytes. The results of this research will help understand the mechanism of AF and provide new vision on the optimized therapeutic options based on the mechanistic insights.

心房肌细胞钙稳态异常在AF发生中扮演重要角色。研究证实，内质网应激（ERS）-自噬反应可促进心房肌细胞纤维化，是AF发生的重要机制之一。我们前期研究发现，calpain-I可以调控肌浆网钙稳态，并对RyR2开闭状态起着一定的调控作用，在AF发生的异常钙释放事件中（钙火花、钙波）起到重要作用。另外的研究显示，在心肌细胞中，calpain-I可通过诱导ERS的发生，促进细胞自噬的发生。提示calpain-I可能通过ERS-自噬反应调控心肌细胞钙稳态，从而促进异常钙释放事件。本项目在业已建立的遥测快速心房起搏兔AF模型上，采用受激发射损耗显微技术、单颗粒冷冻电子显微技术及平面脂质膜单通道技术等手段，从整体、细胞及超微结构水平，进一步探讨calpain-I通过ERS-自噬反应对RyR2蛋白空间构象与肌浆网异常钙释放事件等异常电触发活动的调控机制，明确calpain-I在AF发生中的作用及可能机制。

本项目在我们前期成功建立的遥测快速心房起搏兔房颤模型，以及进行内质网应激-自噬反应在AF患者心房肌中的作用研究基础上，首先观察了AF患者心房肌细胞中Calpain-1、ERS-自噬相关基因与蛋白（GRP78、p-PERK、IRE1、JNK、ATF6、CHOP、LC3B-Ⅱ、Beclin1等）的表达趋势；然后在建立的AF兔动物模型上，采用分子生物学方法进一步验证并探讨了Calpain-1 与ERS-自噬相关基因表达在动物AF模型中的变化规律，从而基本明确了Calpain-1与ERS-自噬的相互作用在AF发生机制中的作用及意义。.本项目主要从以下三个方面进行了相关研究：AF与窦律患者心房肌 Calpain-1、ERS-自噬相关基因表达变化、Calpain-1相关基因表达变化在AF发生机制中作用的研究以及Calpain-1通过ERS-自噬反应在AF发生机制中作用的研究，通过本研究，本项目基本取得比较满意的符合预期的实验结果。.本研究中，我们先通过获取临床AF患者的心房肌组织，通过HE染色以及MASSON染色以及进一步的分子生物学研究中，我们发现，相比于SR患者，AF患者的心房肌细胞中Calpain-1的含量明显增高，且AF患者心房肌细胞中ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP的表达以及自噬相关蛋白LC3B-II以及Beclin-I的mRNA含量明显高于SR患者心房肌细胞。在进一步实验中，我们通过构建快速起搏兔AF模型并通过Calpai-I特异性抑制剂进行干预实验进行探讨。我们发现Calpain-1可能通过CHOP途径激活心肌细胞的ERS过程，并进一步并通过LC3-II自噬流的增加来促进心房肌细胞自噬的程度和发生。更进一步实验中，我们通过通过Calpain-1特异性抑制剂以及ERS特异性抑制剂与激活剂进行干预实验进行探讨。我们发现Calpain-1激活AF心房肌细胞的自噬的程度可被ERS抑制剂降低，通过Calpain-1抑制剂联合ERS抑制剂可显著降低AF心房肌细胞自噬的程度和发生。.综上研究，本项目通过心肌组织标本、动物模型实验以及细胞学实验，采用分子生物学以及生物物理等技术，明确了Calpain-1可能通过ERS中CHOP信号通路进一步激活心房肌细胞的自噬水平，从而在AF发生机制中扮演重要角色，为房颤的发生机制研究提供了进一步的研究思路和方向。