调更汤介导JNK核/线粒体信号通路调控下丘脑神经元细胞凋亡的机制研究

Tiaogeng Decoction effectively alleviate hot flushes and sweating, as well as emotional symptoms; it may regulate estrogen receptor ER alpha, beta expression of hypothalamus in low estrodial environment, and improve the oxidative damage, delay the hypothalamic neural tissue senescence to play neural protection effect in hypothalamus..This project employs confocal laser technology, dual-labeled immunohistochemistry, immunofluorescence, RT-PCR, Western blot and other detection methods to observe anti-apoptotic effects of Tiageng decoction in hypothalamus neurons of ovariectomized rat, as well as to further study Tiaogeng decoction and its active ingredients Icariin and Paeoniflorin improving apoptosis of hypothalamic neuronal GT1-7 induced by tributyltin and look for the target of hypothalamic neurons damage via JNK nuclear / mitochondrial signaling pathway, to prove its hypothalamic neural protection and explain pharmacological mechanisms of Tiageng decoction on menopausal syndrome.

既往研究显示，“调更汤”有效缓解烘热汗出、情绪异常等症状；调节低雌环境下丘脑雌激素受体ERα、β表达，改善下丘脑氧化损伤，延缓下丘脑神经组织衰老，存在下丘脑神经保护作用。.本项目运用激光共聚焦技术、双标记免疫组化、荧光免疫组化、RT-PCR、Western blot等检测方法，观察“调更汤”对去势大鼠下丘脑神经元细胞抗凋亡作用，进一步研究“调更汤”及其有效成分淫羊藿苷和芍药苷对三丁基锡诱导下丘脑GT1-7神经元细胞凋亡的改善作用，以及调节JNK通路核/线粒体信号、减轻受损下丘脑神经元细胞凋亡的作用靶点，揭示“调更汤”的下丘脑神经保护作用，并阐释“调更汤”神经保护作用规律，为中医药防治更年期综合征的药理机制提供思路。

前期研究显示调更汤具有调节衰老大鼠下丘脑雌激素受体系统和改善下丘脑组织线粒体损伤基础上，本项目进一步探讨调更汤及其有效成分芍药苷、淫羊藿苷的下丘脑神经保护作用机制。. 本项目通过TMT磷酸化修饰定量蛋白组学技术分析了调更汤、芍药苷、淫羊藿苷的可能作用通路及磷酸化修饰位点，发现三丁基锡（TBTC）干预GT1-7细胞后，JNK通路被显著富集，其中ASK1、MKK4、MKK7、c-Jun磷酸化水平显著升高；经调更汤、芍药苷、淫羊藿苷干预后具有抑制JNK通路相关因子的作用。. 调更汤的体内实验中，电镜和尼氏染色验证调更汤有改善去势5月龄雌性SD大鼠下丘脑神经元细胞氧化损伤的作用，TUNEL染色显示下丘脑神经组织细胞凋亡率降低。体外试验中，Hochest和AnnexinV-FITC/PI 双染实验证实调更汤具有抗TBTC诱导的下丘脑GT1-7神经元细胞凋亡作用。qRT-PCR和Western blot检测显示调更汤通过ASK1/MKK7/JNK介导的核通路和线粒体通路抑制受损GT1-7细胞凋亡，从而发挥下丘脑神经元细胞的保护作用。. 芍药苷实验中，CCK8和AnnexinV-FITC/PI 双染实验验证芍药苷有抑制TBTC诱导的原代下丘脑神经元细胞损伤作用，可预防TBTC诱导的线粒体膜电位降低，qRT-PCR及Western blot检测显示芍药苷通过MKK4/JNK介导的线粒体信号通路发挥下丘脑神经元保护作用。. 淫羊藿苷实验中，Hochest和AnnexinV-FITC/PI 双染实验验证淫羊藿苷对TBTC诱导的下丘脑GT1-7神经元细胞损伤具有抗凋亡作用，qRT-PCR及Western blot检测显示淫羊藿苷通过MLK3/MKK7/JNK介导的线粒体通路发挥神经保护作用。. 综上所述，本项目阐明调更汤及其有效成分芍药苷、淫羊藿苷可通过以JNK为核心介导的核/线粒体信号通路发挥神经保护作用。调更汤一方面通过抑制JNK核通路中下游c-Jun与Bax的表达抗凋亡，另一方面通过增加JNK线粒体通路下游Bcl-2表达和抑制casepase-9/caspase-3级联下调凋亡，而发挥下丘脑神经保护作用。芍药苷和淫羊藿苷主要通过JNK介导的线粒体通路实现下丘脑神经元细胞保护作用。本项目结果为中医药防治绝经综合征近期和远期症状提供了理论依据。