家蚕质型多角体病毒编码的小开放读码框鉴定与功能研究

Bombyx mori cypovirus (BmCPV) genome consisting 10 dsRNA segments (S1-S10), and each segment encoded with single gene. Our previous study indicated that potential small open reading frames (sORFs) were respectively found in the BmCPV genomic segment S1, S5 and S10. To discover the potential roles of these sORFs, we have screened and obtained the BmCPV susceptible cells from the silkworm, and established the BmCPV reversed genetic system based on the recombinant plasmids containing full-length genomic dsRNA segment cDNA. The initial of sORFs translation was identified using mutations of the initiation codon based on the reverse genetic system. On this basis, the cytopathology, viral replication and multiplication, infectivity of progeny virus and virus particle package could be studied with the mutation and recovery of the sORFs from the dsRNA segments based on the reverse genetic system. Subsequently, cell apoptosis, cell cycle and immune pathways will be studied with overexpression of sORFs in the cultured cells. We plan to disclose the role of these sORFs in the genome of BmCPV from the influences to the virus and cells by the mutation and recovery of sORFs and its overexpression. This project will not only disclose the functions of sORFs in each dsRNA segment, study also provides the novel clues to better understand the genetic information of the BmCPV genome.

家蚕质型多角体病毒(BmCPV)基因组由10个dsRNA节段(S1-S10)组成，每个节段只编码一个蛋白基因。我们的前期研究发现BmCPV基因组的多个节段（S10，S5，S1）可能还编码潜在的小开放读码框(sORFs)，为探明潜在sORFs的功能，本项目在已筛选出BmCPV易感细胞系及建立的基于BmCPV dsRNA cDNA质粒的反向遗传学系统基础上，利用起始密码子突变明确sORFs的翻译起始，研究潜在的sORFs缺失病毒和sORFs修复病毒对细胞的病理变化、病毒增殖复制、子代病毒的感染性、病毒粒子的包装等影响，以及sORFs过表达对细胞凋亡、细胞周期和免疫通路等影响，拟从sORFs缺失和拯救病毒以及sORFs过表达对病毒和细胞的影响来探讨BmCPV基因组编码的sORFs的潜在功能。本项目不仅能明确BmCPV基因组编码的sORFs的功能，还可为认识BmCPV基因组信息提供全新的线索。

家蚕质型多角体病毒1型（Bombyx mori cypovirus 1，BmCPV-1，以下简称BmCPV）作为呼肠孤病毒家族的一员，是质型多角体病毒的典型种，能够特异性感染家蚕中肠组织。BmCPV的基因组由S1-S10 dsRNAs片段构成，通常认为质型多角体病毒基因组的每一个dsRNA片段为单顺反子，只编码一种蛋白质。目前，已发现部分病毒基因组中含有小开放阅读框（small open reading frames, sORFs），可以编码功能性小肽，但BmCPV的基因组dsRNA能否编码功能性小肽还未见报道。本研究中，利用sORF Finder软件预测发现S5 dsRNA的反义链（-）1005-1089 nt区域含有一个S5-sORF，可编码一个27个氨基酸残基的小肽（vSP27）。为了验证S5-sORF的真实存在及vSP27的分子功能。本研究设计特异性引物PCR扩增S5-sORF，扩增产物克隆进原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备vSP27多克隆抗体。细胞免疫荧光和western blotting检测都证实S5-sORF编码vSP27存在。过表达S5-sORF转化细胞，发现BmCPV在S5-sORF转化细胞中的增殖被抑制，过表达S5-sORF对细胞凋亡、免疫通路相关基因的表达无明显影响；通过基于体外转录的BmCPV病毒RNA的反向遗传学系统，构建了S5-sORF起始密码突变的重组BmCPV-S5-sORFmut，发现BmCPV-S5-sORFmut的vp1基因的表达水平高于重组BmCPV病毒，推测S5-sORF编码的小肽vSP27对病毒的增殖有抑制作用；用人工合成的vSP27小肽处理培养细胞，BmCPV的增殖以剂量依赖方式被抑制，证实vSP27可抑制病毒的增殖。另外，我们还发现BmCPV的增殖在起始密码缺失的S5-sORF的体外转录RNA的转染细胞中受到抑制。BmCPV编码vSP27处理培养细胞能够显著性地提高细胞内活性氧（ROS）的水平，说明vSP27小肽可以造成细胞内ROS的稳态失衡。vSP27可以促进NF-κB（p65）入核。进一步证明BmCPV vSP27通过调控细胞内ROS的产生，激活NF-κB信号通路抑制病毒增殖的分子机制。本研究不仅揭示BmCPV基因组编码有活性的病毒小肽，还可进一步加深对BmCPV基因组信息的理解。