高锰胁迫下植物乳杆菌锰转运系统MntR/MntHs的调控机制

Lactobacillus plantarum, an important producer in the fermentation of dairy products, has a probiotics function in bio-removing heavy metals. After a direct long-term domestication, L. plantarum showed a better physiological trait, while MntR/MntHs was identified as the main manganese transport regulation system. However, the internal regulatory mechanism is still not well understood. In this research, L. plantarum CCFM436 was employed as the object. GC-MS, patch clamp and fluorescent double staining methods are used to analyze the fluctuation of membrane lipid composition, membrane current voltage, ion channel structure, permeability, energy auxiliary and amino acid metabolism under manganese stress, which further reveals the physiological basis of membrane and cytoplasm microenvironment. The molecular mechanism of transcriptional regulation between MntR and MntHs is determined by the techniques of gene knockout mutation, DNase I enzyme tracer method, isothermal titration microcalorimetry and gel retardation electrophoresis. With the assistance of transcriptomics and proteomics, the potential functional mechanisms of MntR/MntHs system are investigated by differential expression analysis. The related adaptation mechanism of MntR/MntHs-manganese transport-high manganese stress is further elucidated. This study can provide a scientific basis for directly improving the efficacy of probiotics to reduce the toxicity of heavy metals.

植物乳杆菌是重要的乳制品发酵生产菌株，同时还具有生物减除重金属的益生功能。课题组长期定向驯化的植物乳杆菌CCFM436，呈现优良耐受高锰胁迫生理特性，并鉴定MntR/MntHs为主要锰转运调节系统，然而对其内在调控机制仍缺乏机理性认识。本项目以植物乳杆菌CCFM436为研究对象，利用GC-MS、膜片钳和荧光双染等技术，分析锰胁迫下细胞膜脂组成、膜电流电压、离子通道结构和通透性以及胞内能量辅因子、氨基酸代谢等变化，揭示细胞膜质微环境应对高锰胁迫的生理基础。结合基因缺失突变、DNaseI酶足迹法、等温滴定微量热和凝胶阻滞电泳等技术确定MntR转录调控MntHs的分子作用机制。通过转录组学和蛋白质差异表达分析，探索MntR/MntHs系统潜在的功能机制，进而阐明细胞膜质微环境-MntR/MntHs-锰转运-高锰胁迫适应性关联作用机制。本研究可为定向提高益生菌生物减除重金属毒性效率提供科学依据。

植物乳杆菌是重要的乳制品发酵生产菌株，同时还具有生物减除重金属的益生功能。本研究以具有生物减除锰毒性的植物乳杆菌CCFM436为研究对象，利用GC-MS、高效液相分析等技术，分析锰胁迫下细胞膜脂组成、通透性，胞内能量辅因子以及氨基酸代谢等变化，揭示细胞膜质微环境应对高锰胁迫的生理基础，植物乳杆菌CCFM436胞内微环境生理参数表明，高效液相色谱分析发现细菌胞内游离氨基酸含量，如谷氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和脯氨酸等随着锰离子增加而增加。GC-MS分析在锰胁迫下细胞膜不饱和脂肪酸含量提升，增强了细胞膜流动性。环丙烷脂肪酸C19-cyc含量上升，有利于维持致密膜结构。结合关键基因的异源表达以及蛋白质组差异表达分析探索MntR/MntHs系统潜在的功能机制，进而阐明细胞膜质微环境-MntR/MntHs-锰转运-高锰胁迫适应性关联作用机制，采用组学技术比较不同浓度锰离子胁迫条件下蛋白质表达水平的差异，差异蛋白主要涉及到碳水化合物代谢，能量产生，脂肪酸，氨基酸，RNA合成/翻译；应激反应相关的伴侣蛋白等。在此基础，建立急性锰暴露小鼠模型来评价喂食植物乳杆菌CCFM436对锰毒性的缓解效果。研究发现植物乳杆菌CCFM436可以缓解氧化应激状态和促炎因子水平，对紧密连接蛋白的损伤也有一定的恢复作用。本研究可为定向提高益生菌生物减除重金属毒性效率提供科学依据。