核酸适体用于三阴性乳腺癌分子标志物鉴定及靶向治疗的研究

TTriple negative breast cancer is usually with high degree of malignancy, rapid development and poor prognosis, and lack of target molecule which could be used as targeted therapy.Compared with other types of breast cancer,triple negative breast cancer is still lack of effective method for targeted therapy. Aptamer is a new class of recognition molecule which formatted by single stranded oligoribonucleotide nucleotide folding, similar as antibody, more easier to synthesize and save, easy modification, lower toxicity and lower immunogenicity. This project is based on early breast cancer aptamers screening results, using flow cytometry analysis method, test the aptamers' binding ability by using different molecular subtypes breast cancer cell lines and breast cancer patients' clinical samples to get aptamer which specifically recognize triple negative breast cancer. These aptamers will further be used in triple negative breast cancer protein molecular markers separation and identification study, analysis protein's expression and function. Aptamer will be designed as drug carrier, carrying cell-killing drug, explore the feasibility of aptamer for targeted therapy in triple negative breast cancer. This project will provide new clues for triple negative breast cancer further subtyping, targeted therapy and the molecular mechanism in development process.

三阴性乳腺癌恶性程度高、发展快、预后差，可用于靶向治疗的目标分子十分有限，相比于其他类型乳腺癌，尚缺乏有效的靶向治疗手段。核酸适体是由单链寡核糖核苷酸折叠而形成的一类新型识别分子，与抗体相似，并且具有易于合成和保存、易于修饰、低毒性及免疫原性小等优点。本项目立足于前期乳腺癌核酸适体筛选工作成果的基础上，运用流式细胞仪检测方法，分析核酸适体与不同分子亚型乳腺癌系细胞及乳腺癌患者临床样本结合的特异性，选取特异识别三阴性乳腺癌的核酸适体；利用所得到的核酸适体分离并鉴定三阴性乳腺癌的分子标志物，并进行其在三阴性乳腺癌中的表达和功能分析；将核酸适体设计成药物载体，携带细胞杀伤药物，初步探讨其用于靶向治疗的可行性；以期为三阴性乳腺癌的进一步分子分型及靶向治疗提供新的方法，为了解三阴性乳腺癌发生、发展过程中的分子机理提供新的线索。

三阴性乳腺癌恶性程度高、发展快、预后差,可用于靶向治疗的目标分子十分有限,相比于其他类型乳腺癌,尚缺乏有效的靶向治疗手段。申请人前期研究工作表明，核酸适体与三阴性乳腺癌细胞有优异的结合能力并能被细胞内吞。本项目在前期工作基础上，将核酸适体5TR1修饰并作为阿霉素（Dox）药物载体，证实其与三阴性乳腺癌细胞结合，并将核酸适体药物载体与阿霉素混合构成5TR1-GC-Dox靶向药物。通过MTT实验、Brdu实验和ELISA实验检测靶向药物对正常乳腺细胞MCF-10A及三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞活性、增殖能力及凋亡的影响。并且采用Westernblot检测凋亡相关蛋白caspase-3，Bcl-2和Bax的表达。结果显示5TR1-GC-Dox能够降低阿霉素对正常细胞的活性、增殖能力抑制及诱导凋亡的现象，并且凋亡蛋白发生相应变化，证实了该靶向药物能够降低阿霉素对正常细胞的杀伤作用，一定程度上减轻阿霉素副作用。另一方面5TR1-GC-Dox进一步加强了阿霉素对MDA-MB-231的杀伤作用。MDA-MB-231裸鼠成瘤实验显示，尾静脉注射阿霉素或5TR1-GC-Dox能够抑制瘤体大小，并且5TR1-GC-Dox抑制效果显著高于阿霉素。瘤组织切片HE染色结果表明阿霉素和5TR1-GC-Dox组不同程度出现细胞坏死或凋亡，并且5TR1-GC-Dox效果更好。表明在体内实验中5TR1-GC-Dox能够靶向杀伤三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231。为核酸适体应用于三阴性乳腺癌靶向治疗，提供细胞实验及动物实验基础。研究进展中紧跟三阴性乳腺癌基础研究热点，证实BCL11A基因在三阴性乳腺癌中存在miR-137的调控靶点，且miR-137的上调，可以明显抑制细胞内BCL11A的mRNA和蛋白水平。然后构建BCL11A shRNA慢病毒，对三阴性乳腺癌细胞进行BCL11A shRNA及miR-137过表达的病毒感染及稳定细胞系筛选，经荧光拍照及Q-PCR鉴定，获得稳定表达细胞系，用于成球及裸鼠成瘤实验。最后通过三阴性乳腺癌细胞成球实验及裸鼠成瘤实验，证实BCL11A基因的下调和miR-137的上调，可以明显抑制三阴性乳腺癌细胞的成球和成瘤能力，进而证实BCL11A基因受到miR-137的直接调控。为三阴性乳腺癌靶向治疗提供新思路，以及后续研究开展提供基础。