水母毒素细胞毒性组分的纯化鉴定及其形成穿膜孔道的特征与整体生物学效应

It is reported that jellyfish stings are the most common type of marine life injuries around the world. The cytotoxic component from jellyfish venom can cause extensive damage to the body and plays an important role in toxic process of jellyfish envenomation. However, the structure, toxic mechanism and in vivo biological effects of the cytotoxic component remain obscure so far. Therefore, our objective in this study is to further purify the cytotoxic component from Product 2 (P2) which has been isolated from nematocyst venom of the jellyfish Cyanea capillata by size-exclusion chromatography. Firstly, the purification procedures include liquid chromatography and cytotoxic monitoring methods. Then the full-length cDNA library will be sequenced and its amino acid sequence will be deduced by using the time-of-flight (TOF) mass spectrometry, comparative analysis of the full-length cDNA and transcriptome library, as well as the RACE technique. Besides, the structure and function of the cytotoxic protein will be predicted and analyzed by using the bioinformatics methods. Furthermore, the basic characteristics of the transmembrane pores formed by the cytotoxic component will be studied using the transmission electron microscopy, radioactive isotope labeling, confocallaser scanning microscopy, patch clamp technique and so on. Finally, the deleterious effects of the cytotoxic component on vital organs such as the heart, liver and kidney will be evaluated by compararison of in vivo and in vitro effects with or without antagonistic drugs. Through this study, we can not only extract the active cytotoxic component to further explore its anti-tumor and/or anti-microbial effects, but also provide direct guidance for prevention or therapy strategies against jellyfish envenomation.

水母蜇伤是最常见的海洋生物伤。水母毒素的细胞毒性组分可引起机体广泛损伤，在蜇伤中毒过程中发挥着重要作用。然而，目前水母毒素细胞毒性组分的结构和作用机制尚不清楚，体内生物学效应也不明确。因此本项目拟以发形霞水母作为研究对象，经分子筛过滤初筛的P2组分作为毒素样品，首先，通过液相层析结合细胞毒性监测来定向分离纯化其细胞毒性组分，通过飞行时间质谱分析、全长cDNA文库及转录组文库信息比对并结合RACE等方法获取其全长cDNA并推导氨基酸序列，利用生物信息学方法进行活性蛋白结构和功能预测分析；其次，采用透射电镜、放射性同位素标记、激光共聚焦扫描、膜片钳等方法研究细胞毒性组分形成穿膜孔道的基本特征；最后，结合体内外毒性效应及拮抗药物的干预效果，阐明其对心、肝、肾等重要脏器的损伤效应。通过本课题研究，既可获得细胞毒性组分以指导基于细胞毒作用的抗肿瘤和/或抗菌肽研究，也将为水母蜇伤防治策略提供直接指导。

水母蜇伤是最常见的海洋生物伤。水母毒素的细胞毒性组分可引起机体广泛损伤，在蜇伤中毒过程中发挥着重要作用。然而，目前水母毒素细胞毒性组分的结构和作用机制尚不清楚，体内生物学效应也不明确。本项目以发形霞水母作为研究对象，经分子筛过滤初筛的P2组分作为毒素样品，首先，通过液相层析结合细胞毒性监测的方法，定向分离得到细胞毒性组分S5, D1以及E1组分。进一步采用HPLC对E1组分分析发现样品的主峰是一组小分子物质，蛋白含量却很低，说明即使经过脱盐等多步纯化也不能去除这组小分子物质，它们很可能与毒素蛋白结合紧密，从而影响了毒素蛋白的分离。因此，我们转向分离这些小分子物质，并探索其对水母刺丝囊毒素的影响。采用用凝胶过滤、HPLC等方法，我们定向分离并鉴定了一组相对分子质量相差129，由4~11个谷氨酸残基组成的环γ-聚谷氨酸。此外，我们还证明了这组小分子物质与毒素蛋白紧密结合，且对毒素蛋白结构稳定、活性维持起着至关重要的作用，这组小分子物质的发现为毒素蛋白的分离纯化打开了新的研究思路。另一方面，为全面了解发形霞水母触手组织中的毒素组分，我们采用转录组和蛋白质组学结合的方法全面分析其毒素组分，结果发现发形霞水母刺丝囊中共有69种毒素蛋白，可归为11个功能类别，其中，金属蛋白酶，蛋白酶和成孔毒素占主导地位，分别占已鉴定毒素蛋白的27.5％，18.8％和8.7％，该毒素组分的综合分析为水母蜇伤救治药物的筛选提供了理论依据。在上述毒素组学研究的基础上，我们在前期建立的水母蜇伤动物模型上针对其主要毒素组分进行药物干预。结果发现膜保护剂聚乙二醇6000 (PEG6000)联合广谱的金属蛋白酶抑制剂巴马司他 (batimastat, BB-94)对急性/延迟性水母蜇伤综合征动物模型均具有明显的保护作用。因此，本课题研究为水母蜇伤的综合防治提供了可靠依据。