LncRNA在柑橘木虱对黄龙病菌免疫反应中的功能研究

Asian citrus psyllid is the only natural vector of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas). The apoptotic responses were found in the psyllid midguts when the psyllid was exposured to CLas-infected trees. It has been found that some lncRNA are highly expressed in the insect vectors, which regulate the immune related genes and inhibit the replication of the pathogens. Therefore, this project aims to study the effects of lncRNA in the immune response to Clas in Asian citrus psyllid. 1) Predict the lncRNA genes from the the transcriptome of Asian citrus psyllid, find the differential expressed lncRNA gene within the Clas-infected and non-infected psyllid trasncriptome, analysis the co-expression of lncRNA and mRNA, and then select the target lncRNA for RT-qPCR validation. 2) Predict the target of lncRNA, analysis the tissue and time expression level of the immune response related lncRNA and its target genes, find their subcellular localization and full length. 3) Validate the roles of lncRNA in the immune response of Asian citrus psyllid to CLas and the replication for bacteria in the host by lncRNA interference and overexpression. The completion of the project can reveal the function of specific lncRNA in the immune response of Asian citrus psyllid to Clas, provides an important reference for further research and developmental of new control technology for huanglongbing.

柑橘木虱是黄龙病菌的唯一自然传播媒介，带菌后成虫中肠细胞出现凋亡症状，表现出免疫反应。已有研究发现，卫生媒介昆虫在携带病原体后，部分lncRNA高表达，调控免疫相关基因，抑制病原体的复制。为此，本项目拟研究lncRNA在柑橘木虱对黄龙病菌免疫反应中的作用。1）从柑橘木虱转录组中预测发现lncRNA基因，对带菌与不带菌柑橘木虱转录组lncRNA进行差异表达分析，研究lncRNA与mRNA的共表达关系，再选取目标lncRNA进行RT-qPCR验证；2）预测lncRNA的靶标，针对病原免疫反应相关的lncRNA及其靶标基因，进行组织和龄期表达的定位、亚细胞定位及全长克隆；3）通过基因干扰和过表达实验，验证lncRNA在柑橘木虱对黄龙病菌免疫反应及病原菌在寄主体内复制中的作用。本项目的完成可以揭示特定lncRNA在柑橘木虱对黄龙病菌免疫反应中的功能，为进一步研发黄龙病新型防治技术提供重要参考。

柑橘木虱是黄龙病菌的唯一自然传播媒介，带菌后成虫中肠细胞出现凋亡症状，表现出免疫反应。已有研究发现，卫生媒介昆虫在携带病原体后，部分lncRNA高表达，调控免疫相关基因，抑制病原体的复制。本项目下载NCBI SRA数据库中已公开的柑橘木虱带菌与不带菌、不同发育时期、不同组织等共55个转录组数据，利用已构建的生物信息学流程并做部分修改，挖掘柑橘木虱的lncRNA基因，并对预测的lncRNA与蛋白质编码基因外显子、内含子、转录本长度、外显子数量等特征进行了分析，采用不同地理种群的柑橘木虱对随机选取的10个lncRNA基因，利用RT-PCR进行验证，其中7个能被验证成功，且在不同地理种群中呈差异表达；对带菌与不带菌成虫样本、中肠样本、唾液腺样本中的lncRNA及蛋白质编码基因分别进行差异表达分析，共发现209个差异表达的lncRNA基因，927个蛋白质编码基因，对差异表达的蛋白质编码基因进行功能注释与富集分析，发现2个基因参与免疫代谢通路；根据差异表达lncRNA与相邻蛋白质编码基因的距离及共表达关系，预测了差异表达lncRNA的靶标基因，其中中肠样本中121个差异表达的lncRNA基因对应的顺式调控及反式调控靶标基因分别为1,773个和3,333个，唾液腺样本中73个差异表达的lncRNA基因对应的顺式调控及反式调控靶标基因分别为732个和1,206个，成虫样本中17个差异表达的lncRNA基因对应的顺式调控及反式调控靶标基因分别为217个和566个；对预测的靶标基因进行功能注释与富集分析，共筛选出11个免疫反应相关的靶标基因，对应13个lncRNA基因；通过qRT-PCR验证了成虫中差异表达的2个lncRNA基因，其中1个与预测结果一致，在带菌成虫中高表达；免疫反应相关的lncRNA基因及其靶标基因的龄期表达结果显示，均存在不同发育时期中高表达和低表达的基因，最终筛选出11个免疫反应相关的lncRNA基因及10个靶标基因；选取差异倍数最大的5个lncRNA基因，合成了对应的siRNA，用于后续的RNAi实验。研究结果进一步揭示了lncRNA在柑橘木虱对黄龙病菌免疫反应中的调控作用，为柑橘木虱的防控提供了新的思路。