乌骨绵羊成黑色素细胞异向迁徙的分子调控机理

本项目以乌骨绵羊成黑色素细胞在体内异向迁徙发育为黑色素细胞并反常分布于骨膜、肝脏、脾脏和肾脏进而分泌黑色素形成乌质性状的研究基础上，以普通绵羊为对照，获取不同发育时期的乌骨绵羊胚胎，利用免疫组化技术探索乌骨绵羊成黑色素细胞发育、迁徙和分布的时空规律；利用基因组表达谱芯片高通量检测乌骨绵羊和普通绵羊特定组织器官基因表达谱，构建乌骨绵羊成黑色素细胞异向迁徙的分子调控网络，结合Northern杂交和mRNA荧光定量验证，筛选显著差异表达基因和转录因子；结合差异表达基因相关生理生化知识，挑选2-3个处于网络信号转导中心的关键基因，检测其编码区和调控区序列突变，预测相关调控因子并进行顺反式调控元件互作实验和报告基因分析，筛选控制乌骨绵羊成黑色素细胞异向迁徙的相关基因及其SNP，寻找乌骨绵羊乌质性状的分子标记。

分别采集了成年乌骨和普通绵羊各504和106只血液样品，比较了乌骨和普通绵羊色素剖面，发现乌骨绵羊有显著高的酪氨酸酶活力、碱溶性黑色素、总黑色素含量及真黑色素/总黑色素，再次确认乌质性状是由酪氨酸酶催化合成了显著多的总黑色素和真黑色素并沉淀在不同组织器官造成的。.制作了乌骨和普通绵羊各组织器官石蜡切片，利用多巴氧化酶法、硫酸亚铁吸收法、亚铁氰化钾法、银浸染色法和油红O染色共5种方法，首次在乌骨绵羊骨膜内发现黑色素细胞和色素化的巨噬细胞，同时在乌骨绵羊的肝脏、脾脏和肾脏发现了黑色化的巨噬细胞并含有黑色素颗粒，而普通绵羊上述对应组织均没有黑色素细胞和色素化的巨噬细胞。同时，切片由国际同行鉴定也得到了同样的结论。.屠宰了2月龄乌骨和普通绵羊各6只，对肝脏mRNA进行了高通量测序，普通和乌骨绵羊分别获得254,399,586条和381,363,802条读数，分别产生25.7G和38.51G的数据；普通和乌骨绵羊平均比对率分别为82.15%和83.46%；开展了KEGG和GO分析，共找到7个差异表达基因，上调表达为硬脂酰辅酶A去饱和酶基因，6个下调表达为二氢二醇脱氢酶基因、触珠蛋白基因、载脂蛋白、谷胱甘肽S-转移酶A1类、血清淀粉样基因A1基因和水通道蛋白7基因，初步锁定谷胱甘肽S-转移酶A1类基因参与下调脱黑色素合成从而增加真黑色素合成，导致乌质性状的出现。.克隆了乌骨和普通绵羊酪氨酸酶相关蛋白1基因（TYRP1）8个外显子及其部分侧翼区，找到了12个多态位点，6个在内含子，6个在编码区，分别为C90T、C203T、C1038T、C1107T、C1202T和A1470C。其中C203T和C1202T是错义突变，C203T和C1202T变异均导致缬氨酸(V)变成丙氨酸(A)，其余4个多态位点是同义突变。采用PCR-RFLP和Bi-PASA方法检测了5个位点的多态性，对乌骨、兰坪本地普通绵羊和罗姆尼羊进行了基因频率和基因型的X2检验，关联分析表明该基因多态性对乌质性状没有显著影响。.共培养研究生3人，发表1篇SCI论文和2篇中文文章，主持人获得云南省中青年学术和技术带头人荣誉称号。.成果促进了乌骨绵羊产业发展。为当地农户带来500万元的销售收入。CCTV拍摄了乌骨绵羊并播放3次，为认知乌骨绵羊提供了难得的机遇。逐渐形成科学研究和产业发展并举、资源保护和农民增收并重的良好局面。