亚低温联合脂肪干细胞对脑缺血再灌注损伤后神经血管单元和炎性反应影响的研究

The treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury (CIRI),formerly aiming at the neuron, is often ineffective, therefore, the concept of treating the neurovascular unit (NVU) as a whole has been put forward. Recent studies showed:1.the NVU is involved in the complicated inflammtory reaction induced by the CIRI;2.the mild hypothermia can inhibit the expression of inflammatory cytokines and alleviate the inflammatory reactions after the CIRI；3.the adipose derived stem cells can suppress the inflammation caused by the CIRI and differentiate to the cells that compose the NVU in the ischemic region. We speculate that effective treatment may be acquired by the combined treatment with mild hypothermia that can inhibit the inflammation at early stage and adipose derived stem cells that can alleviate the inflammation further,repair the damaged NVU and generate new NVU. In order to confirm this idea，we set up the CIRI rat model and employ molecular biological and immunofluorescent techniques to observe the effects of the combination of mild hypothermia and adipose derived stem cells on the morphology and quantity of the NVU, inflammatory cytokines and inflammatory cells,the permeability of the BBB, the neurological funcitons and the infartion sizes after the CIRI. This project can clarify the molecular mechanism of the NVU alterations after the CIRI and provide new methods and approaches for the CIRI therapy.

以往脑缺血再灌注损伤（CIRI）的治疗主要针对神经元，但临床效果欠佳，因而学术界提出神经血管单元（NVU）整体治疗的观点。研究显示：1.NVU参与了CIRI诱发的炎性反应；2.亚低温能抑制炎性细胞因子的表达，减轻CIRI后炎性反应；3.脂肪干细胞不仅能抑制CIRI引起的炎性反应还能在损伤部位分化为NVU的细胞成分。课题组设想先用亚低温抑制CIRI后早期炎性反应，保护NVU，再移植脂肪干细胞，进一步减轻炎性反应并利用其在损伤部位的聚集和分化能力修复受损的NVU、生成新的NVU。为此，课题组复制大鼠CIRI模型，采用分子生物学、免疫荧光染色等技术，从整体-NVU-炎性因子三个层次观察亚低温联合脂肪干细胞对大鼠CIRI后NVU形态和数量、炎性细胞、炎性因子、血脑屏障通透性、神经功能和脑梗塞灶的影响。本课题旨在从全新视角阐明CIRI后NVU变化的分子机制，为CIRI的有效治疗提供新的方法和途径。

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一种具有跨胚层分化潜能的成年干细胞，已有的研究表明，在多种神经系统疾病的治疗中，ADSCs有其独特的优势。在脑缺血缺氧疾病的研究中已证实，亚低温(28℃～35℃)对缺血性脑梗死患者具有确切的神经保护作用。然而亚低温联合脂肪干细胞对脑缺血再灌注损伤的研究在国内外尚属空白，因此，本课题联合亚低温和脂肪干细胞治疗脑缺血再灌注损伤，对联合治疗对神经血管单元的保护作用进行系统性研究。利用SD大鼠制备暂时性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型，用脑温探针控制大鼠体温于亚低温状态，同时经不同途径注射ADSCs及ADSCs蛋白提取物ADSC-E（Cell-free extracts from ADSC），结果发现亚低温明显降低大鼠死亡率、改善神经功能；通过基因芯片分析亚低温组与常温组的差异，发现亚低温治疗组HSP70在基因水平显著降低。同时我们发现，在细胞凋亡通路中两个重要靶点IKK表达上调，Cn表达下调，提示亚低温涉及损伤神经元凋亡通路并为我们下一步寻求联合治疗提供了新的方向。在ADSCs治疗方面我们发现，静脉注射ADSC-E效果明显优于脑室注射及腹腔注射，并且与ADSCs相比，静脉注射ADSC-E更能快速的改善神经功能缺陷。同时由于亚低温治疗后1天就可以发现梗塞面积有所减少，但ADSCs只有晚期才能对神经功能恢复发挥作用，因此我们联合两种治疗方式，进一步增强神经保护功能。在体外实验中，我们选取神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系，用糖氧剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型模拟脑缺血再灌注损伤，发现与OGD组相比，亚低温组、ADSC-S组以及两者联合刺激组中细胞活力均明显增强，但在两者联合刺激后保护效应更为显著。为进一步了解其具体是通过哪一种机制发挥作用，我们通过RT-PCR监测了炎性因子及神经营养因子的mRNA水平的表达，我们发现在联合治疗组炎性细胞浸润和促炎因子明显减少，而抑炎因子和神经生长因子升高。综上所述，与单一的亚低温治疗组和脂肪干细胞治疗组相比，两者联合治疗能更有效的下调炎性应答，改善神经功能缺陷，减少梗死区域，发挥更好的神经功能保护作用。