肉毒碱棕榈酰基转移酶-II基因变异对肝脂代谢的影响与机制

Recently, we have reported that the mitochondrial fat metabolism and energy generation were associated with the mutations of carnitine palmitoyltransferase-II (CPT-II) gene exon 4. However, the exact mechanism remains to be defined. In view of the above and combining clinical data, we hypothesize that mutations of exon 4 or the lower activation of CPT-II, located in the inner membrane of mitochondria, resulting in disorder of fat metabolism in liver. In order to certify above hypothesize, we shall observe firstly the effects of liver fat metabolism and mitochondrial ATP generation by the lievr cells transfected with constructed plasmids contained CPT-II variants or CPT-II microRNA(miRNA) in vitro. And then, we shall investigate the effects of mitochondrial fatty acid oxidation and ATP generation at the levels of histopathology, gene transcription and CPT-II expression by injecting plasmids of the constructed mouse CPT-II miRNA into the mouse model in vivo to testify that the transcription and expression of hepatocyte effective CPT-II is a key factor in regulating liver mitochondrial fatty acid oxidation and energy generation, and to explore the pathogenesis mechanism of liver fat matablism abnormality and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and finally put forward new useful information for liver fat metablism abnormality, prevention and treatment of NAFLD.

前期研究发现肉毒碱棕榈酰转移酶-II(CPT-II)基因4号外显子突变与脂代谢和能量产生密切相关，其机制有待阐明。据此并结合临床，假设位于线粒体内膜的CPT-II基因变异或其外显子突变导致酶活性低下，可引起肝细胞脂代谢异常。为证明上述假设，拟通过细胞模型和已构建的CPT-II变异及miRNA表达干扰的有效质粒，转染细胞，观察CPT-II基因变异对肝脂代谢和线粒体ATP能量产生的影响；建立脂代谢异常动态发生的鼠模型，构建鼠CPT-II miRNA干扰质粒，经体内注射和对照研究，从病理组织学、基因转录和酶蛋白表达水平上，观察CPT-II miRNA干预对线粒体肝脂肪酸氧化和ATP能量产生的影响，论证细胞中有效的CPT-II转录与表达是调控肝线粒体脂肪酸氧化与供能的重要因素，探讨肝脂代谢异常及非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病机制，为临床肝脂代谢异常及NAFLD的防治提供新的有用信息。

项目背景：线粒体内膜上的肉毒碱棕榈酰转移酶-II(CPT-II)与肉毒碱作用，将脂酰CoA生成脂酰肉毒碱，从线粒体内膜转运到线粒体基质进行β-氧化供能。临床上病毒感染、炎症、高热等可影响CPT-II活性，基因变异可使线粒体脂肪代谢紊乱，加重线粒体损伤和减少ATP生成。为证明上述假设，论证细胞中有效CPT-II转录与表达是调控肝线粒体脂肪酸氧化与供能的重要因素，探讨肝脂代谢异常及非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病机制，为临床肝脂代谢异常及NAFLD 的防治提供新的有用信息。.主要研究内容：以肉毒碱相似物(THP)拮抗循环肉毒碱，影响肝脂肪代谢模型和已构建的CPT-II 变异及miRNA 表达干扰的有效质粒，转染细胞，观察CPT-II基因变异对肝脂代谢和线粒体ATP 能量产生的影响；建立脂代谢异常动态发生的鼠模型，构建鼠CPT-II miRNA 干扰质粒，经体内注射和对照研究，从病理组织学、基因转录和酶蛋白表达水平上，观察对线粒体肝脂肪酸氧化和ATP 能量产生的影响。.重要结果：发现患者游离脂肪酸代谢紊乱及线粒体β-氧化异常，由CPT-II基因变异、酶活性低下所致，显示病毒感染诱发线粒体损伤、且伴有能量供给障碍。缺陷变异CPT-II活性与温度密切相关，发现CPT-II缺陷致能量代谢障碍的分子基础；首次报道CPT-II分子缺陷使线粒体脂肪酸β-氧化和ATP生成低下致能量代谢障碍的分子机制；从细胞模型及动物模型的CPT-II基因和蛋白表达等方面进行探讨，揭示病毒感染致CPT-II缺陷的量代谢障碍机制，为NAFLD的防治提供了新概念和理论依据。.关键数据：在国内、外发表论文12篇（SCI收录8篇，中文核心2篇）；获国家发明专利1项；参加国内外学术交流4次；培养研究生4名；获省、市科技奖励4项。.科学意义：NAFLD可进展为脂肪肝肝炎、肝纤维化和肝硬化，甚至肝癌，其患病率在发达国家为30%左右，我国接近20%，且有年轻化趋势，已为继病毒性肝炎后第二大慢性肝病，使糖尿病发生风险增高3.8～11倍，与代谢综合症互为因果。脂肪进入线粒体氧化取决于两个重要因素：即运送载体-肉毒碱及关键酶-CPT-II。以THP拮抗肉毒碱成功制备了理想模型，观察了对肝脂肪氧化的影响。建立非基因敲除、非高脂肪、非高糖的NAFLD代谢调控模型，将有助于探讨脂代谢异常和NAFLD发病机制，具有开发应用前景。