鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌生物被膜致大鼠肺气虚证干预机制的研究

肺气虚证已成为老年人死亡的第一位直接病因。以铜绿假单胞菌（Pa）为代表的顽固性耐药菌常引起慢性难治性呼吸道感染，主要原因之一是形成生物被膜。被膜内的细菌能够逃逸抗生素的杀伤和机体免疫系统的清除,成为潜在的感染源，根据中医久病必虚的理论，我们已用Pa感染大鼠肺部致呼吸道慢性感染，成功复制出肺气虚证模型。本研究拟通过抑制pa生物膜控制呼吸道慢性感染从而预防肺气虚证的发生。经筛选发现鱼腥草素钠（SH）具有显著的抗Pa生物被膜作用。因此我们试图：1）分析SH干预后体外Pa生物被膜形成过程中黏附、被膜分散等关键基因表达谱的改变； 2）检测分析密度感应分子释放及相关基因表达的变化；3）观察SH对大鼠体内Pa生物被膜形成的影响,分析肺气虚发病的相关免疫分子（细胞因子、防御素等）的变化和对肺气虚证发生的干预效果，以阐明SH抑制Pa体内外生物被膜发生的机制，为SH控制呼吸道慢性感染从而预防肺气虚证提供依据。

本项目已完成。重要结果如下：. 1.体内试验：通过呼吸道慢性感染建立大鼠肺气虚证的模型。鱼腥草素钠(SH)干预，通过肺气虚症候表现的观察，大鼠肺支气管组织器官病理检查、肺组织匀浆铜绿假单胞菌CFU检测，血流血气分析、局部及血流免疫学指标IL-8、IL-6、TNF-α 和IFN-γ 、β-防御素、免疫复合物指标分析，都提示鱼腥草素钠SH早期干预铜绿假单胞菌生物被膜呼吸道感染的大鼠能预防肺气虚证的发生。.2.体外试验.1）SH能够抑制铜绿假单胞菌（PA）生物被膜形成并对其粘附具有清除作用，对早期生物被膜粘附的清除作用更强于成熟期生物被膜，SEM观察表明SH处理组黏附载体上的细菌明显减少，连续用药后载体上未见有生物被膜结构，菌量明显减少且细菌形态改变，由杆状变为球杆状，CLSM下看出，SH干预后空白组的荧光强度最强，生物被膜的完整性好，SH、AZM干预下荧光强度相对较弱，表明生物被膜的结果不完整。.（2）SH抑制PA藻酸盐、总蛋白、生物被膜的形成，抑制作用呈现浓度及时间依赖性；RT-PCR结果表明SH能够使藻酸盐调节基因algZ、algR 与合成基因algD、algG 表达水平下降。表明SH通过下调藻酸盐合成相关基因的表达，进而干扰铜绿假单胞菌生物被膜的形成，而藻酸盐是构成PA生物被膜之一。.（3）SH能够影响PA生物被膜的分散；SEM显示SH在作用100 min早期能够有效 . 抑制生物被膜的分散，24 h后能够破坏生物被膜形成；WB结果表明生物被.膜分散蛋白bdlA表达受到了SH的抑制，下调趋势与药物浓度有关，qRT-PCR结果表明SH使生物被膜分散基因bdlA、tpbA、tpbB和rhlA的表达下调，pelD和pelA的表达上调；表明SH在早期作用阶段能够抑制生物被膜的分散，从而使细菌不能造成新部位的感染；作用后期SH主要破坏生物被膜的结构，致生物被膜细菌的死亡。. (4)RT-PCR结果表明SH使lasI下调，使rhlI上调；qRT-PCR结果进一步证明了在不影响细菌生长的情况下SH依然能够有效的抑制QS调控的毒力因子的产生，并且拥有特性抑制las QS系统的AHL合成基因lasI和转录调节基因lasR，并呈现出剂量依赖性的特点。SH也能够下调lasR调控的基因lsaA、pslA和 phzM；lasB、pqsA、rhlR、gacA、rsm和toxA变化不明显。