Cdc25B和14-3-3ε在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换中作用机制的研究

The 14-3-3 proteins bind to target proteins containing specific phospho-serine/theonine motifs, which can in turn alter their catalytic activity or cellular localization .Our recent study demonstrated that PKA can phosphorylate Ser321 of Cdc25B in mouse oocytes. Phosphorylation of Cdc25B on Ser321 creates a binding site for 14-3-3ε adaptor protein, which functionally inactivates Cdc25B by sequestration in the cytoplasm and arrest in G2 phase of meiosis I in mouse oocytes.Little is know about whether exist 14-3-3 protein or which isoforms of 14-3-3 protein exist in mouse one-cell fertilized eggs. To test the role and function of 14-3-3εand Cdc25B protein in G2 arrest of mouse one-cell fertilized eggs. Our previous studies demonstrated that 14-3-3ε and Cdc25B were present in mouse one-cell fertilized eggs (G1,S,G2,M phase) by RT-PCR and Western blotting . Moreover, we construct expressive vector of 14-3-3ε and try to explore the molecular mechanism of G2/M transition of mouse one-cell fertilized eggs by overexpression 14-3-3ε and knockdown of 14-3-3ε. It will be of great importance for the study of mechanisms regulating the fertilized eggs development of human and other mammals.

14-3-3蛋白结合的靶蛋白包含一个特殊的磷酸化的丝氨酸/苏氨酸结构域，和14-3-3结合能改变他们的催化活性和亚细胞定位。我们通过对小鼠卵母细胞的研究表明，蛋白激酶A(PKA)可直接磷酸化Cdc25的321位丝氨酸，此位点磷酸化后导致14-3-3ε蛋白的结合，Cdc25B活性受抑，卵母细胞发生G2期阻滞。小鼠一细胞期受精卵中是否存在14-3-3ε蛋白以及和cdc25B之间是否存在相互作用，迄今国内外尚未见报道。为了验证14-3-3ε蛋白和Cdc25B蛋白在小鼠一细胞期受精卵G2期阻滞中的作用，本研究以小鼠一细胞期受精卵为研究对象，通过RT-PCR和免疫印迹实验证实确实存在14-3-3ε和Cdc25B蛋白。通过显微共注射14-3-3ε和Cdc25B的mRNA和14-3-3ε的干涉实验探讨14-3-3ε调控一细胞期受精卵G2/M转变的分子机制，为哺乳动物受精卵早期发育的机理研究提供实验依据。

本课题以小鼠一细胞期受精卵作为研究对象，研究14-3-3蛋白在小鼠一细胞期受精卵G2期阻滞中的作用。本课题通过构建14-3-3ε和Cdc25B表达载体，在体外转录成mRNA，利用显微注射技术，观察共注射14-3-3ε和Cdc25B（突变型和野生型）对小鼠一细胞期受精卵G2/M转化的影响；构建了14-3-3ε和Cdc25B荧光表达载体，体外注射于小鼠G1期受精卵中，间接观察外源性14-3-3ε和Cdc25B在小鼠一细胞期受精卵中的定位。我们的研究证实：（1）在小鼠一细胞期受精卵中存在14-3-3蛋白的表达，并且主要是14-3-3ε、ζ两个亚型。14-3-3ε的表达从G1期到G2期逐渐增加，M的表达又有所下降（2）单独注射14-3-3εmRNA、共注射14-3-3εmRNA和Cdc25B(野生型)、共注射14-3-3ε和Cdc25B-149D对卵裂率没有影响；共注射14-3-3ε和Cdc25B-149A能显著提高小鼠受精卵的卵裂率。(3)当敲低14-3-3ε时，Cdc25B不能激活胞核中的MPF，因而不能启动有丝分裂的恢复。（4）14-3-3ε与Cdc25B结合，阻止Cdc25B进入细胞核，从而不能激活MPF，使一细胞期受精卵发生G2期阻滞。利用突变技术，构建Cdc25B的突变型质粒（149A、149D），证明14-3-3ε能和模拟磷酸化的149D发生结合，而不能和不可磷酸化的149A发生结合。（5）14-3-3ε和Cdc25B在G1、S期共定位于细胞浆，而在G2期Cdc25B入核，而在M期，二者共定位于细胞浆。本研究证实了14-3-3ε和Cdc25B在调控小鼠一细胞期受精卵G2/M的转化中发挥着重要的调节作用，这为以后研究哺乳动物受精卵的早期发育提供相关实验依据。