选择性杀伤肺癌细胞的miRNA的筛选和功能研究

The excessive generation of reactive oxygen species (ROS) is one of the hallmarks of cancer and a potential avenue for the selective killing of cancer cells. Nowadays, it remains largely unknown whether miRNAs can be used to cause selective killing of lung cancer cells by boosting ROS level. This proposal aims to first identify ROS-elevating miRNAs by combining bioinformatics analysis, and then use our already established high throughput-screening platform BD855 to validate their effects. Through this, we expect to identify miRNAs that selectively enhance ROS and cause cell death in lung cancer cells but not in normal cells. Then, we will investigate the repertoire of RNAs targeted by those ROS-enhancing miRNAs. For this, we will employ high throughput sequencing of RNAs isolated after crosslinking immunoprecipitation (HITS-CLIP) of selected miRNAs. Based on these experiments, we will explore different combinations of ROS-enhancing miRNAs aimed to have a more potent effect on selective lung cancer cell killing. Furthermore, therapeutic efficiency of combinations of ROS-enhancing miRNAs will be tested in a mouse model of lung cancer through systemic delivery. Through the above-mentioned research we expect to develop an innovative miRNA-based approach that may have the potential to be applied in human cancer therapy.

肿瘤细胞具有增加活性氧（Reactive oxygen species,ROS）生成的生化特性。该特征是潜在的选择性治疗靶点之一。能否利用miRNAs调控ROS水平从而达到选择性杀伤肿瘤的方法尚待研究。因此本项目拟通过经生物信息学分析构建与人ROS代谢通路相关的miRNA文库，利用已经建立的检测ROS水平的BD855高通量筛选平台进行筛选，发现特异调控肺癌细胞氧化应激的miRNA。并对其调控网路利用紫外交联免疫沉淀RNA结合高通量测序技术进行高通量分析鉴定，在此基础上对调控不同通路的miRNAs进行系统组合，进而研究其对肺癌细胞杀伤的有效性和特异性，更进一步利用系统给药方式在小鼠肺癌模型中研究其治疗效果。通过上述研究希望发现能够特异、有效杀伤肺癌细胞的miRNAs或者miRNAs组合，为肿瘤的miRNAs治疗提潜在供分子靶标和理论依据。

肺癌是全球发生率、死亡率最高的恶性肿瘤。miRNAs在肺癌的发生发展中扮演重要的角色。肺癌差异表达的miRNAs对靶基因的调控机理对肺癌的诊断治疗具有指导意义。在前期研究基础上我们筛选获得了对肺癌有选择杀伤的miRNAs。为了研究miRNAs的调控机理，我们建立了非放射性标记RNA的PAR-CLIP等方法进行靶基因的研究。非放射性标记的PAR-CLIP方法通过化学核苷类似物和“点击”化学反应标记插入EC的新生RNA，通过激光凝胶扫描成像法或者转膜后化学发光法检测RNA标记信号，同时利用Western Blot检测蛋白位置，利用RNA和蛋白共定位分析候选RNA结合蛋白是否结合有RNA,然后对结合的RNA进行提取检测。该方法具有安全、快速、简便、经济等特点，解决了传统PAR-CLIP方法标记毒性大（放射性标记）、耗时、成本高的问题，在RNA蛋白功能研究方面具有广泛用途。.在本项目的资助下开展了miR-506 调控肺癌细胞增殖的机理研究 。对前期研究的miR-506在肺癌中的靶基因进行了新发现，确认了CDK6 同样是miR-506的靶基因，并且miR-506调控了肺癌细胞的增殖。进一步研究了RNA结合蛋白在miR-506抑制靶基因中的调控作用。研究发现RNA结合蛋白在miR-506调控CDK6的过程中是必须的。该结果对于肿瘤miRNAs治疗提供了新的理论依据，在肿瘤治疗中不但需要考虑miRNAs的表达水平，而其需要同时考虑RNA结合蛋白对靶基因的影响。.RNA结合蛋白参与了RNA代谢的各个过程，影响了遗传信息的表达和传递，RNA结合蛋白研究一直受到关注。我们通过利用核苷类似物EU标记RNA的方法建立了高通量RNA结合蛋白鉴定的新技术RICK。该技术成功在Hela细胞里鉴定了295个之前Olig（dT）方法未被鉴定的RNA结合蛋白。该技术能够分离鉴定细胞内几乎所有类型RNA及其结合蛋白，为RNA结合蛋白的发现和研究提供了有力的工具。