Hsp16.3通过JNK/p38信号通路调控自噬的发生参与MTB潜伏感染的形成

Functional deficiency in autophagy of macrophage is one important mechanism of formation of latent TB infection (LTBI). Relative references have been proved that components proteins of MTB could impacted autophagy by inducing reactive oxygen species (ROS). It’s Jun N-terminal kinase (JNK) that connects ROS and autophagy. We have proved that Hsp16.3 could influence the autophagy of macrophage. It’s possible that Hsp16.3 could impact autophagy through JNK/p38 signaling pathway in LTBI, and promote MTB to survive in macrophage. In this study, MTB wild strains and Hsp16.3 gene deletion strains will be used to infect mouse and human macrophages, to observe the changes of the autophagy function of macrophage. It’s will be determined the changes of PI3P and TLRs of autophagy-related molecules, and ROS-dependent JNK/p38 signaling molecules by the methods of Western-blot, laser confocal microscopy and siRNA. We will further clarify the impact of Hsp16.3 to JNK/p38 pathway in peritoneal macrophage of LTBI mouse model. We will further prove Hsp16.3 regulating autophagy and explore the immune evasion mechanisms of LTBI.

巨噬细胞自噬功能减弱是MTB潜伏感染（LTBI）形成的机制之一。已有文献证实在潜伏感染中MTB菌体蛋白能够通过诱导活性氧自由基（ROS）的产生影响自噬的发生，而连接ROS和自噬的信号分子主要是JNK。预实验发现MTB菌体蛋白Hsp16.3能够影响巨噬细胞的自噬，提示Hsp16.3可能通过JNK/p38信号通路调控LTBI中自噬的发生，促进MTB在细胞内存活。本研究拟使用MTB野生株和Hsp16.3基因缺失株分别感染小鼠和人的巨噬细胞，观察巨噬细胞自噬功能的变化；通过Western-blot、激光共聚焦和siRNA技术测定巨噬细胞中自噬相关分子PI3P和TLRs、以及ROS依赖的JNK/p38信号分子的变化；通过制备小鼠LTBI模型，进一步明确Hsp16.3对模型鼠腹腔巨噬细胞自噬相关通路JNK/p38的影响。解析在LTBI中Hsp16.3对自噬的调控作用，探索LTBI免疫逃逸的分子机制。

结核病（tuberculosis，TB）高发病率和死亡率的主要原因之一是大量处于潜伏感染状态的人群活化成为活动性结核病。休眠菌可在宿主细胞内持续存在，不引起机体任何症状和表征，但在一定条件下能重新复制从而使机体致病。有实验表明，敲除Hsp16.3蛋白的结核分枝杆菌在骨髓巨噬细胞以及THP-1 细胞中难以进入休眠状态。表明了Hsp16.3与MTB 潜伏感染密切相关，在MTB 进入休眠状态而持续存活的过程中起着重要作用。. 构建阳性重组质粒pKO-Hsp16.3，根据同源重组的原理和基因敲除技术，将阳性重组质粒pKO-Hsp16.3 电转入 BCG 和毒株 H37Rv 的感受态细胞中，经过硫酸卡那霉素和蔗糖两次筛选，分别获得BCG和H37Rv 菌株的Hsp16.3 基因突变株。将构建的卡介苗和H37Rv 的Hsp16.3基因缺失株作用于小鼠巨噬细胞Raw264.7，主要通过透射电镜和激光共聚焦显微镜观察自噬体的形成和LC3点状聚集物的形成，结果发现MTB的Hsp16.3 基因突变株作用巨噬细胞后，LC3点状聚集物明显增多，自噬体形成数量明显增加，表明MTB的Hsp16.3 基因突变株能促进小鼠巨噬细胞Raw264.7的自噬；通过Western Blot 技术分析自噬相关分子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1等表达水平的变化，结果显示LC3II的表达显著增加，LC3-Ⅰ和BeclinⅠ的表达呈现下降趋势；然后分别观察小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬的卡介苗和H37Rv 的Hsp16.3基因缺失株菌体的形态和CFU计数，发现感染MTB基因缺失株的巨噬细胞中吞噬的MTB菌体较少，结果表明抑制Hsp16.3蛋白的表达后能促进巨噬细胞发生自噬，促使更多的MTB在自噬中被清除。综上实验结果表明，结核分枝杆菌中的分泌蛋白Hsp16.3在MTB发生休眠的过程中，充分发挥了抑制自噬发生的作用，促使了胞内MTB的存活，从而促进了结核分枝杆菌潜伏感染（LTBI）的发生。. 研究Hsp16.3在巨噬细胞感染MTB过程中调控自噬发生的机制，对阐明结核分枝杆菌潜伏感染形成的机制提供一定的理论依据。期望Hsp16.3可作为活动性结核病和LTBI患者诊断的辅助指标，并对高危患者的结核病筛查和早期诊断具有重要意义，从而为结核病的防控提供有意义的参考。