Uhrf2基因缺失致卵泡发育异常的分子基础及机制研究

Granulosa cell is essential for oocytes growth, maturation and ovulation. The gene expression in granulosa cells as well as morphology and function alters as the development of the follicle. The modification of genomic DNA changes the conformation of chromatins as well as the expression of a series of related genes. However, the research of how DNA modification alters the development and function of granulosa cells is limited. Herein, we found UHRF2 expressed in granulosa cells. The Uhrf2, which is similar to Uhrf1, is an essential cofactor of maintenance DNA methylation. Binding assays demonstrate a cooperative interplay of Uhrf2 domains that induces preference for hemi-methylated DNA, the substrate of maintenance methylation, and enhances binding to H3K9me3 heterochromatin marks. We established the Uhrf2 knockout mouse by the method of gene trap. The fertility, as well as ovulation was down-regulated in the knockout females. The estrous cycle was prolonged and more atretic follicles were found in the female knockout mouse. The deficient function of ovary, together with the special localization of UHRF2 indicated the deficiency of granulosa cell. This project will study how UHRF2 knock out leads to the deficient development and function in granulosa cells. In mechanism, we will try to elucidate how UHRF2 regulates DNA-5hmc. In summary，our research will be helpful for providing a new prospect that how granulosa cell influences follicle in ovary.

在卵泡发育过程中, 颗粒细胞的形态和功能发生了显著的变化，基因表达谱也随之改变。DNA修饰可以从染色质上改变DNA构型，并影响多个基因的表达。然而在颗粒细胞中，DNA整体水平修饰变化如何影响颗粒细胞发育及功能，目前的报道还十分有限。我们发现UHRF2定位于卵巢颗粒细胞。UHRF2被报道能特异性识别5hmc，同时也参与DNA半甲基化到全甲基化的转变，以及组蛋白的修饰。本实验构建了UHRF2基因敲除鼠。敲除雌鼠出现生育力下降，卵子释放数量减小，动情周期延长，闭锁卵泡增多等多个表型。这些卵巢功能缺陷以及UHRF2的特殊定位暗示UHRF2缺失导致颗粒细胞异常。本项目研究UHRF2对颗粒细胞发育及功能的影响，并拟阐明UHRF2对DNA-5hmc可能的调控机理。通过本项目的研究，可以加深对颗粒细胞表观调控的认识，并最终为预防、诊断和治疗颗粒细胞异常引起的雌性不育提供理论支撑。

UHRF2在多个器官和组织中表达，但是其具体的生物功能目前尚不清楚，特别是在卵巢的UHRF2是否具有生物学意义？本研究围绕着UHRF2在雌性生殖中的功能进行了一系列的研究。发现卵巢中的Uhrf2定位于各级卵泡颗粒细胞，并随着卵泡的不断成熟，在颗粒细胞中表达呈增加的趋势。本研究首次发现卵巢中的UHRF2可以调控雌性小鼠的生育，UHRF2缺失导致雌性小鼠性周期延长、雌激素水平下调、释放的卵子数量减少，最终导致雌鼠生育力不足。UHRF2功能失活造成颗粒细胞成熟出现异常，对颗粒细胞进行RNA-seq测序，发现有1244个基因发生了显著差异，其中有658个基因上调，586个基因下调。功能富集预测发现颗粒细胞增殖和激素合成功能出现缺陷。UHRF2是如何造成这些功能基因发生变化的？ UHRF2机制上的一个核心问题是：UHRF2是否调控DNA-5hmC。本研究发现UHRF2对DNA-5hmC总体来说起着正调控的作用。Uhrf2功能失活导致DNA-5hmC异常，少量（2775）peaks发生了上调，但是多数（21197）peaks发生了下调。那么UHRF2调控DNA-5hmC有什么具体的分子生物学意义？通过研究，发现这些区域的DNA-5hmC在启动子区域的上调会导致一系列转录因子结合受阻，进而影响了基因的表达。而gene body区的DNA-5hmC是和基因的表达正相关，因此promoter区域的DNA-5hmC上升导致了基因转录受阻，进而导致gene body及整体水平5hmC下调。本项目不仅研究了UHRF2对DNA-5hmC的调控，还结合UHRF1一起研究了UHRF家族对DNA-5hmC调控的规律。虽然UHRF1和UHRF2在结构上具有相似性，但是对DNA-5hmC的调控是复杂的。不同的系统作用不尽相同。在雄性生殖细胞中UHRF1对DNA-5hmC起着抑制作用，而在雌性的颗粒细胞中UHRF2则对DNA-5hmC起着正相关的调控。目前本项目已发表了一篇SCI论文，论文的内容是：UHRF1对TSS区域的DNA-5hmC起着抑制作用，而这部分的5hmC对基因的转录至关重要。另外UHRF2对DNA-5hmC的促进作用正在投稿过程中。综上所述，本项目该获得的理论成果可以为由颗粒细胞功能不足引起的卵巢功能低下女性提供诊断和治疗的提供理论支撑。