TWEAK对山羊uNK细胞分化和功能的调节作用及其机制

The regulation of uterine natural killer (uNK) cells of phenotypes and functional transition has been closely associated with implantation failure and reproduction development. However, the comprehensive functions of uNK cell in early pregnancy still remain unclear. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apotisis (TWEAK) is an important regulator of the development, homeostasis, and function of the immune system. In the present study, the miRNA target TWEAK was detected by using miRNA microarray and dual-luciferase assay. Furthermore, the regulatory mechanisms of TWEAK expression post-transcriptionally and its role in phenotypes regulation and secretory functions of uNK cells, as well as the effects of embryo types and steroids on the above regulation were detected using quantitative RT-PCR, western blot, flow cytometric assay, and RNAi assay. This study will illustrate TWEAK regulation mechanisms of phenotypes and immune function of uNK cell. Moreover, this study may be pivotal significance to improve the successful rate of domestic animal reproduction, transplantation immune, and provide new mechanistic insights into anti-infection immunity in reproductive tracts.

妊娠早期子宫内膜基质部子宫NK细胞（uNK）表型及功能变化与胚胎能否成功植入以及妊娠确立密切相关，但其分化及功能调节机制尚不十分清楚。肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂（TWEAK）在机体正常生理条件下免疫动态平衡的维持以及炎症状态下免疫功能调节中具有重要作用。本研究应用miRNA芯片分析技术、双荧光素酶检测系统等筛选靶向调节山羊uNK细胞中TWEAK的miRNA，进一步通过荧光定量RT-PCR、Western blot、流式细胞术、基因干扰及过表达等方法检测miRNA对uNK细胞中TWEAK转录后水平的表达调控机制及其在山羊妊娠早期uNK细胞分化及分泌表达中的调节作用，以及不同类型胚胎和激素对该作用的影响，阐明山羊妊娠早期uNK细胞表型及免疫功能的TWEAK分子调控机制。本研究对全面了解妊娠免疫，提高胚胎移植成功率和家畜繁殖率，以及生殖道抗感染免疫机制等均具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

妊娠早期子宫内膜基质部子宫NK细胞（uNK）表型及功能变化与胚胎能否成功植入以及妊娠确立密切相关，但其分化及功能调节机制尚不十分清楚。肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂（TWEAK）在机体正常生理条件下免疫动态平衡的维持以及炎症状态下免疫功能调节中具有重要作用。miRNA在调节NK细胞分化及免疫功能中发挥重要作用。本项目中，我们检测分析了TWEAK对山羊外周血NK（pNK）细胞及uNK细胞分化及免疫功能的影响，同时基于深度测序技术比对分析了山羊pNK细胞及uNK细胞microRNA表达谱，并通过TargetScan及双荧光素酶等技术分析了靶向调节TWEAK基因的miRNA。通过转染技术检测了目的miRNA通过靶向调控TWEAK基因表达水平，进而调控uNK分化及功能。进一步检测了不同胚胎类型对山羊uNK细胞中目的miRNA介导TWEAK表达的调控作用及其对NK细胞功能的影响，以及对胚胎发育的影响。结果表明，TWEAK能显著负调控uNK细胞细胞毒性及IFN-γ等的分泌功能。另外，我们的研究表明山羊uNK细胞中miRNA_1直接靶向调控TWEAK基因且负调控其表达水平。进一步研究表明，miRNA_1通过负调控TWEAK进而调控uNK细胞中NKG2D、PRF及IFN-γ表达水平。不同类型胚胎（正常囊胚、股雌激活胚、核移植胚）对miRNA_1介导TWEAK的调控研究表明，核移植胚相较于正常囊胚和股雌激活胚，能显著提高miRNA_1表达水平并降低TWEAK表达水平，进而增强uNK细胞的NKG2D、PRF及IFN-γ表达水平。值得注意的是，能够导致孕羊发生流产的小反刍兽疫病毒（PPRV）也可以通过调控miRNA_1，进而改变山羊NK细胞的细胞毒性，增强病毒在宿主细胞的复制水平和感染性。总之，我们的研究表明，miRNA_1通过直接负调控TWEAK表达水平，进而调节山羊uNK细胞的细胞毒性及IFN-γ表达水平。值得注意的是，miRNA_1介导对山羊uNK细胞免疫功能的调控可能与核移植胚较低的妊娠成功率以及繁殖障碍相关病毒感染密切相关。本研究对于全面了解妊娠免疫，提高胚胎移植成功率和家畜繁殖率，以及生殖道抗感染免疫机制等均具有重要的理论意义和潜在的应用价值。