水凝胶携带NgR1沉默的神经干细胞移植治疗脊髓损伤的研究

Neural stem cells (NSC) transplantation is one of the prospective treatments for spinal cord injury. However, a major barrier need to be overcome: limited rate of neuronal differentiation. Recent studies indicated that myelin associated inhibitory factors and their common receptor NgR1 participate in the differentiation process of NSC. Their interaction mediated NSC differentiated into astrocytes. And Our previous work has shown that hydrogel was biocompatible and could be used as a carrier in NSC transplantation. This study intends to test the effects of NgR1 gene silencing NSC delivered by hydrogel on the treatment of spinal cord injury in rats. Immunofluorescence, BDA tracing and electron microscopy are untilized to detecte NSC differentiation after transplantation, axonal regeneration and myelination in rats. Western blot detects the levels of proteins that reflecting nerve regeneration, extracellular matrix reconstruction, inflammatory and apoptosis. Motor functional and electrophysiological recovery is determined by BBB scoring and evoked potentials. Our study aims to clarify the role and mechanism of NgR1 silencing in the differentiation of transplanted NSC, as well as the therapeutic effects on nerve regeneration and functional recovery in spinal cord injury rat. And our work is expected to provide new ideas and methods for the treatment of spinal cord injury in the future.

神经干细胞（NSC）移植是治疗脊髓损伤具有应用前景的手段之一，然而尚需克服移植后有限的神经元分化率问题。基于脊髓损伤后释放的髓磷脂相关抑制因子与其受体NgR1参与NSC分化过程的调控，两者的相互作用介导NSC向星形胶质细胞分化；同时课题组前期工作表明水凝胶具有良好生物相容性，可作为NSC体内移植的载体，本研究拟利用RNAi沉默NSC的NgR1表达，诱导NSC向神经元定向分化，并以水凝胶搭载NSC移植体内，实现细胞的有效局部递送，治疗大鼠脊髓损伤。以免疫荧光、BDA示踪、电镜等检测移植后NSC的分化及大鼠神经轴突再生、髓鞘形成等情况，Western blot检测神经再生、外基质重建、炎症因子及凋亡相关蛋白的水平变化，结合运动功能与电生理评价，阐明NgR1沉默对移植体内后的NSC分化的影响，以及该治疗对脊髓损伤大鼠神经再生、运动功能恢复的作用和机制，有望为今后脊髓损伤的治疗提供新的思路。

脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后轴突生长和神经再生受限受到一些抑制性蛋白的影响，例如髓鞘相关抑制因子，包括： Nogo-A, 髓鞘相关糖蛋白（myelin-associated glycoprotein (MAG)）和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte-myelin glycoprotein (OMgp)）。Nogo-66 receptor 1 (NgR1) 是介导这些抑制因子在中枢神经系统发挥作用的关键受体，在脊髓损伤后它的激活可以抑制轴突的再生。在脊髓损伤的大鼠模型中，用NgR1的拮抗剂或者是敲除NgR1在脊髓损伤后运动功能恢复的更好，轴突再生也更明显。椎管内和静脉递送治疗药物是传统的中枢神经系统递送药物方法，但这些方法有其局限性，例如：多次注射增加感染的风险、在损伤区域内的浓度聚集较低、药物代谢速度过快和组织穿透能力较差。用慢病毒作为一种基因治疗的载体可以在中枢神经系统长时间稳定的表达，加强了基因治疗在中枢神经系统的效率。用慢病毒搭载短发卡RNA（shRNA）可以局部注射到损伤区域，稳定的长时间下调特定的内源性基因的表达，这种特性正好适用于类似神经系统这样自身恢复速度较慢的组织，同时这种方法也克服了传统递送治疗药物方法的缺点。目前，在体内应用慢病毒干扰抑制NgR1功能对脊髓损伤大鼠神经再生及功能的恢复的作用尚不明确。探讨慢病毒介导的NgR1功能沉默对脊髓全横断损伤大鼠运动功能恢复及神经组织修复的作用。脊髓损伤后，自第6周起至第8周，LN组BBB评分显著高于LC组（P<0.0 5）。HE染色结果提示LN组脊髓空洞的面积相比于LC组在距离损伤中心3mm范围内显著减少（P<0.0 5），且在距离损伤中心5mm范围内LN组细胞凋亡水平明显低于LC组（P<0.0 5）。相比于LC组，LN组在脊髓损伤区域可以观察到更多的NF200阳性神经纤维， Synaptophysin阳性突触蛋白生成明显增加（P<0.0 5），并且神经逆行示踪结果表明，LN组在脊髓损伤节断以上FG阳性神经细胞数量更多（P<0.0 5），以上结果提示治疗组在损伤区域的头尾端神经纤维连接更为紧密。我们的结果表明在脊髓损伤的区域，沉默Ngr1能够促进神经分化，抑制细胞凋亡，增加神经组织的修复能力，改善运动功能的恢复。