上皮钠通道在被动吸烟气道黏液高分泌状态中的作用及相关的蛋白酶调控机制

Mucus hypersecretion in airway is a major manifestation in both bronchitis and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) caused by cigarette smoking, also a key point leading to bacterial colonization and recurrent episodes of airway inflammation. Epithelial Na+ channels (ENaC) govern the volume of the watery sol layer by generating an osmotic gradient across lining epithelial cells, but little is known about the expression and regulation of ENaC in the hypersecretive airway. Uncoupling of ion and fluid absorption via ENaC from airway epithelial cells leads to an impaired mucociliary clearance and airway obstruction. Hyperactive ENaC activity appears to be the fundamental alteration that underlies mucus hypersecretion in the airways in COPD. Previous studies showed that trypsin can stimulate ENaC activity by cleaving ENaC subunits, whereas α1-antitrypsin down-regulates ENaC activity as shown in our preliminary data. We hypothesize that passive smoke exposure (PSE) up-regulates ENaC in tracheal epithelial cells by interrupting the protease-antiprotease balance. We will systematically mutate putative proteolytic substrates and key amino acid residues in ENaC subunits for trypsin, matrix metal protease-9, and elastases. Results of these studies may provide novel information that will provide the molecular basis for developing novel therapeutic strategies (ENaC and protease inhibitors) to combat life-threatening mucus occlusion in chronic PSE-challenged lungs.

气道黏液分泌增多是由吸烟引起的支气管炎和慢性阻塞性肺疾病的主要表现，也是导致细菌定植、气道炎症反复发作并不断进展的关键。来源于气道上皮细胞的上皮钠通道（Epithelial Na+ channels，ENaC）所介导的离子和液体吸收脱偶联能导致黏液纤毛清除功能受损以及气管阻塞，ENaC活性的增强似乎是慢性阻塞性肺疾病患者气道黏液高分泌现象的病理生理学基础。既往研究发现胰蛋白酶能够通过剪切ENaC亚单位而提高ENaC活性，我们前期工作结果发现α1抗胰蛋白酶能够下调ENaC的活性，据此推测被动吸烟可能通过破坏蛋白酶-抗蛋白酶之间的平衡而上调气道上皮细胞的ENaC。应用剪切和定点突变的方法我们将获取胰蛋白酶、基质金属蛋白酶-9和弹性蛋白酶对ENaC亚单位进行裂解的关键位点，这将为临床采用新的治疗策略（给予ENaC和蛋白酶的抑制剂）治疗被动吸烟引发的肺脏疾病中致命的气道黏液阻塞提供分子学基础。

吸烟可以引起肺上皮及内皮损伤，并可能诱发呼吸系统疾病，例如肺水肿、肺气肿、支气管炎及慢性阻塞性肺疾病等。香烟燃烧时释放的烟雾中含有大约4700多种已知化学成分，包括尼古丁、反应性醛、致癌物质、自由基、剧毒化合物等，这些物质经呼吸道吸入后能诱导包括细胞凋亡、氧化应激、炎性反应和肿瘤在内的多种损伤。气道黏液分泌增多是由吸烟引起的支气管炎和慢性阻塞性肺疾病的主要表现，也是导致细菌定植、气道炎症反复发作并不断进展的关键。本项目研究首次应用实时定量RT-PCR发现在人肺脏标本中，吸烟人群肺组织中α、β和γ上皮钠通道亚单位的mRNA表达水平发生了上调；Western blot结果与上相似，同时上皮钠通道的蛋白表达水平与其肺功能密切相关；慢性阻塞性肺疾病病人肺组织肺泡液体清除率明显增加。另一方面，香烟烟雾提取物中含有多种有害物质，可以诱导包括细胞凋亡、促炎性反应、氧化应激在内的多种反应，诱发多种呼吸系统疾病，例如肺气肿、肺水肿、成人呼吸窘迫综合征等。通过应用尤斯灌流系统记录单层细胞中的短路电流，我们发现香烟烟雾主要成分甲醛和巴豆醛能够抑制人肺上皮细胞阿米洛利敏感性电流，同时降低小鼠肺组织肺泡液体清除率。能够促进细胞外调节蛋白激酶传导通路蛋白磷酸化，证实其能够抑制上皮钠通道的功能活性。可能通过释放组织活性氧增加，引起肺功能损害。同时我们与美国德克萨斯健康医学中心吉宏龙教授合作，应用异源表达人αβγ上皮钠通道的爪蟾卵母细胞对香烟烟雾有效成分调控上皮钠通道活性的机制进行了研究。有关蛋白酶对α和γ上皮钠通道亚单位裂解的关键位点研究目前也基本完成。通过本项目组成员的共同努力和合作，项目已基本按计划顺利完成。在国内外著名期刊公开发表标注基金资助论文19篇，其中被Sci收录5篇。相关研究成果获辽宁省科学技术奖励二等奖两项，培养硕/博士研究生共9人。通过本项目的研究工作基础获得2017年国家自然科学基金课题面上项目及2015年辽宁省自然科学基金课题各一项。