Bmi-1信号系统调控喉癌实体瘤干细胞自我更新机制研究

新近研究已证实喉癌组织中存在极少量具有自我更新、无限增殖的肿瘤干细胞，正是这群特异性细胞始动了喉癌的产生和发展，它们对治疗的耐受是造成肿瘤复发、转移的根源。研究喉癌干细胞的生物学特性，阐明它们的自我更新机制，是制定靶向杀伤策略的关键。本项目拟在前期研究的基础上，纯化喉鳞癌实体瘤干细胞，检测Bmi-1信号通路中重要的信号分子，明确其活化情况，应用RNA干扰技术沉默Bmi-1基因，结合体外及体内实验，以期证实Bmi-1负性调控INK4a/ARF的转录，抑制P16ink4a和P14ARF蛋白的表达，是维持喉癌干细胞的高增值状态的关键环节；靶向沉默Bmi-1基因可以上调该信号通路，抑制喉癌干细胞增殖，促使其凋亡。本研究是喉癌干细胞自我更新分子机制研究的新切入点，将阐明Bmi-1信号系统调控喉癌干细胞自我更新的分子级联机制，为针对喉癌干细胞的靶向治疗提供新的分子靶点。

本研究按照实验计划，培养人喉鳞状细胞癌实体瘤细胞，以流式细胞仪纯化CD133+肿瘤细胞；以CD133-喉癌细胞为阴性对照，测定CD133+肿瘤细胞的迁移侵袭能力及3代克隆形成率，实验表明，CD133+肿瘤细胞有强于其他亚群的迁移、侵袭及克隆形成能力，证明了其干细胞特性。随后，从CD133+喉癌细胞基因组DNA克隆INK4a、ARF基因启动子区基因，应用萤火虫荧光素酶系统，发现INK4a基因、ARF基因启动子活性低于对照组CD133+肿瘤细胞，qPCR及Western blot技术也发现CD133+喉癌细胞中Bmi-1基因及Bmi-1蛋白水平高于对照组，而INK4a基因、ARF基因的mRNA转录水平及p16INK4a蛋白、p14ARF蛋白的表达水平均低于对照组；设计合成针对人Bmi-1基因的Bmi-1-RNAi慢病毒，靶向沉默CD133+肿瘤细胞中的Bmi-1基因，再次测试CD133+喉癌细胞中INK4a基因及ARF基因启动子活性、mRNA转录水平及蛋白表达水平，较Bmi-1基因沉默前，表达水平均有明显下降，且有统计学差异；同时，Bmi-1基因敲除后，CD133+肿瘤细胞克隆形成能力及增值能力明显降低，凋亡水平升高，体外成瘤能力也减弱，说明Bmi-1负性调控INK4a/ARF的转录，抑制P16ink4a和P14ARF蛋白的表达，是维持CD133+喉癌干细胞的高增值状态的关键环节，靶向沉默Bmi-1基因可以上调该信号通路，抑制喉癌干细胞增殖，促使其凋亡。本研究阐明了Bmi-1信号系统调控喉癌干细胞自我更新的分子级联机制，为针对喉癌干细胞的靶向治疗提供了新的分子靶点。