基于PsARRO-1基因的牡丹试管苗不定根发生基因调控网络研究

Some problems have unable to effectively solved on Tree Peony in vitro, such as rooting difficulty, low root quality, adventitious roots and transfusion tissue of stem cannot connect, low survival rate of transplanting. Therefore, study on molecular mechanism of tube seedlings adventitious rooting of Tree Peony should be one of the possible ways to solve the problem. The early stage of the research found that PsARRO-1 gene is closely related to the occurrence period of root primordium initiation and IAA content change. It speculated that the gene is one of the regulating genes of tree peony on test-tube seedling adventitious rooting, but there is not yet clear whether there are some other key genes. Researchers found that we can build gene regulation networks of some plant phenotypic characteristics by yeast two-hybrid technology, Co-IP technology and gene chips, and we can determine the key genes of some phenotypic characteristics through the functional classification of gene regulation networks. The research is aimed to building the gene regulation networks of tube seedlings adventitious rooting on Tree Peony, and find out the key genes controlling the adventitious rooting, based on the complete sequences of PsARRO-1, genetic transformation system of Arabidopsis and yeast two-hybrid library，overexpression vector of Co-IP which we obtained before. In order to establish the efficient plant regeneration system, and provide molecular biology theory and technical support for efficient plant regeneration system of tree peony.

牡丹试管苗根系发生困难、不定根与茎的输导组织不连接、移栽成活率低等问题至今未能得到有效解决。因此，开展牡丹试管苗不定根发生分子机理研究，应是解决该难题可能途径之一。课题组前期研究发现，牡丹PsARRO-1基因与试管苗根原基起始、IAA含量变化及发生时期等密切相关，推测该基因应是调控牡丹试管苗不定根发生的基因之一，但尚未明晰是否还有其他关键基因存在。现研究发现利用酵母双杂、Co-IP及基因芯片技术，可以构建基于某一基因的基因调控网络图，通过对网络图进行功能分类及相关基因功能鉴定，可以确定与某一性状相关的关键基因。本研究拟在获得PsARRO-1基因、建立拟南芥遗传转化体系和生根相关酵母双杂文库、Co-IP过表达载体等前期工作基础上，构建基于PsARRO-1基因的牡丹不定根发生相关基因网络调控图，并寻找出控制不定根发生的关键基因，以期为建立牡丹高效植株再生体系提供分子生物学方面的理论和技术支撑。

牡丹试管苗根系发生困难、不定根与茎的输导组织不连接等问题至今未能得到有效解决。课题组前期研究发现，牡丹PsARRO-1基因与试管苗根原基起始及发生时期等密切相关，推测该基因应是调控不定根发生的关键基因之一。本研究拟在前期工作基础上，构建基于PsARRO-1基因的牡丹不定根发生相关基因网络调控图，并寻找出控制不定根发生的关键基因，以期为建立牡丹高效植株再生体系提供理论依据。主要研究结果如下：通过对牡丹‘凤丹白’根系发育关键期转录组测序发现PsARRO-1在转录组中的仅有一条相关序列，不含有内含子，其氨基酸序列在21个牡丹品种中具有一定的保守性；亚细胞定位显示其定位在质膜；功能分析发现，该基因在根原基形成期显著高表达；过表达PsARRO-1可显著促进拟南芥侧根形成，增强根系活力，减少O2-和H2O2的积累，并显著提高根系发生相关基因SOD、WRKY41及IAA27等的表达；外施生长素后，PsARRO-1显著上调表达；进一步转化突变体拟南芥发现PsARRO-1可部分恢复突变体短根表型，并显著促进不定根发生；同源转化牡丹实生苗，发现沉默表达PsARRO-1可显著抑制牡丹根系活力；通过牡丹根系发生关键期酵母双杂交文库筛选，共获得18个PsARRO-1互作蛋白；进一步通过Y2H和BiFC验证明确了PsHMGB3、PsLTP、PsSOD、PsWRKY41及PsIAA27b均与PsARRO-1存在互作关系；对互作基因进行功能分析发现，过表达PsHMGB3、PsSOD、PsLTP可分别促进拟南芥侧根数量增加、主根伸长、根系活力增强；进一步通过互作基因间表达模式分析发现，PsARRO-1、PsSOD、PsLTP均可促进WRKY41及IAA27的表达，其中，PsARRO-1与PsSOD之间可相互促进，而PsARRO-1与PsLTP相互抑制表达。综上表明，PsHMGB3、PsLTP、PsSOD、PsWRKY41及PsIAA27b作为牡丹不定根发生的关键基因，可与PsARRO-1形成互作网络，协同调控不定根的发生。