靶向复合Nogo核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗研究

成年中枢神经（CNS）损伤后神经元再生能力弱的主要原因是中枢微环境髓磷脂抑制蛋白的存在，其中尤以Nogo最为重要，它对神经突起的生长有很强的抑制作用。Nogo可能存在多个功能位点，但普遍认为胞外段1024-1089 由66个氨基酸残基组成的Nogo-66环状结构及其氨基末端起决定性作用。核酸疫苗接种是近年发展起来的一种治疗神经损伤的有效手段，不产生非生理性副作用及有害自身免疫反应，与神经营养活性肽等药物/制剂相比，不存在血脑屏障及微渗透泵损伤问题。本研究分别克隆Nogo-A的Nogo-66、氨基末端区域及佐剂基因Flt3L，并由此构建靶向复合Nogo核酸疫苗。体内对动物进行疫苗接种，检测抗血清中抗体效价，结合凋亡分析、束路追踪等技术观察其对损伤脊髓轴突再生的影响和对受损神经元的保护作用；体外观察抗血清对培养神经元突起生长的影响，为脊髓及其它CNS损伤的治疗及药物开发提供新的方法和理论。

研究表明，成年中枢神经（CNS）损伤早期神经元再生能力弱的主要原因是由于中枢微环境髓磷脂抑制因子Nogo、MAG及OMgp的存在，其中尤以Nogo最为重要，它对神经突起的生长有很强的抑制作用。Nogo可能存在多个功能位点，但普遍认为胞外段由66个氨基酸残基组成的Nogo-66环状结构及其氨基末端（Amino-Nogo）起决定性作用。核酸疫苗接种是近年发展起来的一种治疗神经损伤的有效手段，不产生非生理性副作用及有害自身免疫反应，与神经营养活性肽等药物/制剂相比，不存在血脑屏障及微渗透泵损伤问题。为进一步探讨Nogo的功能及寻找针对Nogo可能的功能抑制剂，我们尝试用基因工程方法构建共表达Nogo-66、Amino-Nogo及佐剂基因Flt3L（FL）的靶向复合Nogo核酸疫苗，体内与脂质体或纳米金一起免疫动物，ELISA法检测抗血清中抗体的效价，结合凋亡分析、束路追踪及行为学检测等技术观察其对损伤脊髓轴突再生的影响、受损神经元的保护作用及功能的恢复情况；体外观察在Nogo蛋白存在的情况下抗血清对培养神经元突起生长的影响。结果表明制备的靶向复合Nogo核酸疫苗免疫动物后产生的抗血清可中和Nogo蛋白对神经元突起生长的抑制作用，同时体内实验证实核酸疫苗接种可促进神经元轴突的再生，对神经元具有明显的保护作用并可促进大鼠脊髓损伤后功能的恢复。其机制可能是通过体内诱导产生的特异性Nogo抗体，封闭体内Nogo蛋白的相应功能位点，进而逆转其介导的轴突再生抑制效应来实现的。该研究结果不仅可为脊髓损伤，也可能为其它CNS损伤后的治疗及有关药物开发提供重要的方法和理论依据。