模拟梗死心肌物理特性的弹性基质对鼠骨髓CD34+细胞分化的诱导作用研究

移植时机是影响心肌梗死（MI）后细胞移植疗效的重要因素，以MI后7至14天开展细胞移植疗效最佳，但其机理尚不明确。MI后病损心肌微环境的改变是影响移植细胞分化及疗效的关键，以往研究多集中于MI后细胞/炎性因子等生化微环境，对微环境中的物理因素却鲜有关注。我们首次提出"梗死心肌"适宜"物理微环境（即硬度或弹性）可诱导干细胞向益于病损心脏修复的细胞类型分化"的设想；本项目前期已成功应用不同浓度聚丙烯酰胺凝胶这一弹性基质，完成不同时段梗死心肌硬度的体外模拟；并拟以此为培养基底，进一步开展小鼠骨髓CD34+细胞培养，从细胞表型、细胞功能、细胞骨架和信号通路关键分子角度，比较不同弹性基质诱导骨髓CD34+细胞向内皮祖细胞分化的差异及其机理，探讨梗死心肌样基质硬度在决定骨髓源干细胞分化中的作用；为揭示MI后细胞移植"时机-疗效"规律提供新的理论依据，并有望通过干预和调控梗死心肌硬度拓宽移植时间窗。

基质物理微环境（即硬度）是影响细胞生物学行为的重要因素。然而，梗死后心肌硬度的时间依赖性变化是否通过影响移植细胞分化，从而决定心肌梗死（MI）细胞治疗最佳时机（MI后7-14天），目前尚不明确。本课题利用软基底细胞培养体系，完成梗死心肌不同时间点基质硬度的体外模拟，并从细胞表型和细胞骨架角度，比较了梗死心肌样弹性基质在诱导其向内皮系细胞分化的作用差异。该课题完成了初设目标，并探讨了不同硬度基质对骨髓CD34+和CD34-单个核细胞的诱导作用差异。主要内容及结果：（1）建立模拟梗死心肌硬度的软基底细胞培养体系：基于Balb/c小鼠MI后不同时段梗死心肌硬度原子力显微镜的测定结果，利用不同配比浓度的聚丙烯酰胺薄层凝胶实现其体外模拟，成功制备软基底细胞培养体系，四种培养基底的弹性模量为4kPa、15kPa、42kPa和72kPa，分别模拟MI后24h、1h、7-14d和14-28d梗死心肌硬度；（2）骨髓CD34+细胞的分选鉴定：通过密度梯度离心法及免疫磁珠分选技术获取Balb/c小鼠骨髓CD34+细胞，流式细胞技术分析显示，分选细胞CD34+纯度约为93%；（3）骨髓CD34+细胞的诱导分化研究： 42Kpa基质胶ac-LDL/UEA-1双阳性细胞数量明显高于与其他三种基质胶（p均<0.001），且ac-LDL/UEA-1双阳性表达率亦表现出较其他基质胶更高的趋势，42kPa基质胶内皮系细胞表面标记vWF、CD31和VEGFR2的表达率亦为最高；（4）细胞骨架研究：4kPa和15kPa基质胶细胞铺展呈近圆形，边缘有黏着斑形成，片状伪足边缘F-actin聚集并形成波纹型的骨架，而42kPa和72kPa基质胶细胞形态多呈梭型，黏着斑呈片状分布在细胞边缘；（5）CD34+和CD34-细胞的分化对比研究：不同硬度培养条件下，CD34+细胞ac-LDL/UEA-1双阳性表达、vWF、CD31和VEGFR2的表达率均显著高于CD34-细胞。由此可见，模拟MI后7-14d梗死心肌的42kPa基质硬度更有利于骨髓细胞向内皮系细胞分化，CD34+细胞的分化效率明显高于CD34-细胞，细胞表型的表达差异可能与细胞感受外部应力产生的细胞骨架变化相关。该课题从细胞外基质“适宜硬度”这一全新视角入手，揭示了利于移植细胞分化的理想物理微环境，为揭示细胞最佳移植时机的潜在机理提供了新的理论依据。