MicroRNA-221/222基因簇调节肝胰岛素敏感性及机制研究

In the present study, we found that the expression levels of miR-221/222 were down-regulated in the livers of db/db diabetic mice. Overexpression of miR-221/222 in primary hepatocytes significantly decreased the gluconeogenic gene expression and promoted insulin-stimulated Akt phosphorylation. In contrast, silencing of miR-221/222 in primary hepatocytes increased hepatic gluconeogenesis and glucose production. In this study, the mechanism by which miR-221/222 controls glucose and lipid metabolism in the liver will be explored. The regulatory effect of miR-221/222 on hepatic insulin sensitivity will be studied by insulin tolerance test and euglycemic hyperinsulinemic clamp. The regulatory effect of miR-221/222 on gluconeogenic gene expression will be studied. The direct target genes of miR-221/222 in metabolism will be analyzed. And we hope that this project would be helpful to develop medicine to treat type 2 diabetes mellitus.

前期研究显示，miR-221/222在db/db小鼠肝脏表达显著降低。过表达miR-221/222抑制肝细胞糖异生基因表达，增加胰岛素刺激的Akt磷酸化水平。相反，抑制miR-221/222促进糖异生，增加肝细胞葡萄糖产生。据此我们推测，miR-221/222可能参与了肝糖脂代谢，我们拟在前期工作基础上展开如下研究：以db/db、ob/ob为模型，采用腺病毒介导肝特异性过表达或干扰miR-221/222，利用胰岛素耐受，高胰岛素正常葡萄糖钳夹等方法研究miR-221/222对肝胰岛素敏感性有无调节作用；采用Real-time PCR、Western Blotting分析miR-221/222对糖异生相关基因表达有无调节作用；采用双报告基因分析miR-221/222在代谢方面的新靶基因。明确miR-221/222调节肝胰岛素敏感性的分子机制，以期为治疗2型糖尿病提供新的潜在靶点。

1、项目研究背景. 我国糖尿病患者已接近1亿，且逐年增加，严重影响我国居民健康。90%以上糖尿病患者属于2型，而针对2型糖尿病临床药物种类较少。我国自主创新药物发展强劲，要在2型糖尿病新药研发中获得具有自主知识产权新药，须进一步揭示其发病机制，寻找新的治疗靶点。.2、主要研究内容.（1）营养对miR-221/222表达的调节。主要研究进食、饥饿、再进食miR-221/222表达的变化。.（2）体内研究miR-221/222对糖尿病模型小鼠血糖及胰岛素敏感性的调节。通过产生miR-221/222过表达及干扰腺病毒，实现肝脏过表达及干扰miR-221/222，并研究其对葡萄糖/胰岛素耐受的调节作用、对肝脏脂代谢的影响。.（3）体外原代肝细胞水平研究miR-221/222调节胰岛素敏感性及脂代谢的潜在机制。主要研究miR-221/222对胰岛素信号通路相关蛋白是否有调节作用，对肝细胞葡萄糖产生的影响。并确定miR-221/222靶基因。.3、重要结果及关键数据.（1）成功构建miR-221过表达及干扰腺病毒，实现miR-221/222在肝细胞过表达或抑制。建立了miR-221/222表达与营养水平之间的联系。.（2）在ob/ob小鼠水平，发现抑制miR-221/222显著改善ob/ob小鼠肝脏脂肪堆积，降低肝脏甘油三酯水平，并对脂肪变性导致的肝细胞炎症反应有明显改善作用。抑制miR-221/222对肝脏或血清游离脂肪酸、总胆固醇、血清胰岛素水平没有显著影响。此外，在高脂饮食诱导的脂肪肝模型小鼠体内，抑制miR-221/222的表达得到类似结果。.（3）预测并分析了miR-221的潜在靶基因，并用双报告基因对其3’UTR进行了验证。发现2个基因（ERɑ、ADIPOR1）的3’UTR能被miR-221强烈抑制。通过定点突变实验，进一步确定了miR-221调节这两个基因的作用位点。此外，miR-221/222可以调节肝脏甘油三酯合成及脂肪酸氧化相关基因的表达，如Srebp-1c、Ppar-ɑ等。进一步研究发现，miR-221能调节ADIPOR1蛋白表达水平，miR-221调节肝脏糖脂代谢可能部分通过ERɑ及ADIPOR1来完成。.4、科学意义. 阐明了miR-221/222与肝脏糖脂代谢之间的联系，可能为2型糖尿病及脂肪肝的治疗提供新的潜在靶点。